發(fā)布時(shí)間：2021-08-19 19:27

　　第一部分TRIM59抑制TC45去磷酸化STAT3促進(jìn)EGFR/EGFRvⅢ膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展目的:EGFR/EGFRvⅢ亞型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤致病因子和致病機(jī)制不明,本研究旨在探討TRIM59在EGFR/EGFRvⅢ亞型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制。方法:利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TRIM59的表達(dá)水平,并分析其表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系;通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和顱內(nèi)原位移植瘤模型觀察敲低TRIM59對(duì)EGFR/EGFRvⅢ膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的影響;采用蛋白免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)EGFR/EGFRvⅢ對(duì)TRIM59表達(dá)的調(diào)控作用;利用RNA-Seq和基因富集分析檢測(cè)敲低TRIM59對(duì)EGFR/EGFRvⅢ下游信號(hào)通路的影響;通過(guò)蛋白免疫印跡和免疫共沉淀技術(shù)探索TRIM59介導(dǎo)EGFR/EGFRvⅢ調(diào)控STAT3信號(hào)通路的分子機(jī)制。結(jié)果:TRIM59在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)明顯高于正常組織和低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織,高表達(dá)TRIM59的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后不良;敲低TRIM59明顯抑制EGFR/EGFRvⅢ促進(jìn)的膠質(zhì)母... 

【文章來(lái)源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

TRIM59在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)量顯著高于在其他組織中的表達(dá)量

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文27為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，我們對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（GDS1816）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床樣本進(jìn)行生存分析同樣發(fā)現(xiàn)TRIM59高表達(dá)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后差（圖2B）。圖2.Kaplan-Meier法分析TRIM59表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后相關(guān)性。A.生存分析TRIM59高表達(dá)與低表達(dá)患者預(yù)后。B.生存分析GDS1816數(shù)據(jù)集TRIM59高表達(dá)與低表達(dá)患者預(yù)后。Figure2.Kaplan-MeieranalysisoftherelationshipglioblastomapatientsprognosiswithdifferentTRIM59expression.A.Kaplan–MeieranalysisofpatientswithhighTRIM59protein-expressingGBMversuslowTRIM59protein-expressingtumors.B.Kaplan–MeieranalysisofpatientswithhighTRIM59mRNA-expressingGBMversuslowTRIM59mRNA-expressingtumors.ExpressiondataofTRIM59mRNAweredownloadedfromtheGDS1816dataset.3.3EGFR激活上調(diào)TRIM59蛋白和mRNA水平為了證明TRIM59與EGFR的關(guān)系，我們首先對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（GDS1816）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TRIM59在增殖型和間質(zhì)型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，而這兩種亞型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤高表達(dá)EGFR，這提示EGFR與TRIM59表達(dá)存在正相關(guān)性（圖3A）。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，我們首先在LN229和U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EGFR組成型激活突變體EGFRvIII構(gòu)建EGFR組成型激活穩(wěn)定細(xì)胞系。然后，在LN229、LN229/EGFRvIII細(xì)胞和U87、U87/EGFRvIII細(xì)胞中進(jìn)行westernblot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照細(xì)胞相比，EGFRvIII組成型激活突變明顯上調(diào)TRIM59蛋白和mRNA表達(dá)水平（圖3B、C）。我們用EGF刺激過(guò)表達(dá)EGFR的U87細(xì)胞后，加入EGFR酪氨酸激酶抑制劑Erlotinib處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未刺激組相比，

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文28EGF刺激明顯上調(diào)TRIM59蛋白表達(dá)，而Erlotinib阻斷EGFR激活，抑制了TRIM59蛋白表達(dá)上調(diào)（圖3D）。我們用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建成功的EGFRvIII-KD（激酶失活突變體）高表達(dá)U87/EGFRvIII-KD細(xì)胞系進(jìn)行westernblot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與U87/EGFRvIII細(xì)胞相比，EGFRvIII-KD突變下調(diào)TRIM59蛋白表達(dá)（圖3E）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGFR/EGFRvIII上調(diào)TRIM59蛋白和mRNA水平，并且依賴EGFR/EGFRvIII酪氨酸激酶活性。圖3.EGFR激活上調(diào)TRIM59蛋白和mRNA水平.A.在增殖型和間質(zhì)型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TRIM59mRNA表達(dá)水平明顯高于前神經(jīng)元型。B.在U87和LN229細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EGFRvIII對(duì)TRIM59蛋白表達(dá)的影響。P:親本細(xì)胞，vIII：LN229或U87細(xì)胞過(guò)表達(dá)EGFRvIII。箭代表EGFR，箭頭代表EGFRvIII。C.qRT-PCR分析EGFRvIII對(duì)TRIM59mRNA表達(dá)影響。P:親本細(xì)胞，vIII：LN229或U87細(xì)胞過(guò)表達(dá)EGFRvIII。D.在過(guò)表達(dá)EGFR的U87細(xì)胞中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑Erlotinib抑制EGFR磷酸化和EGFR激活上調(diào)TRIM59蛋白表達(dá)。箭代表EGFR。E.Westernblot分析EGFRvIII激酶失活突變對(duì)TRIM59表達(dá)的影響。P:親本細(xì)胞，vIII：U87細(xì)胞過(guò)表達(dá)EGFRvIII。箭代


本文編號(hào)：3352004