第一部分aPKCι促進(jìn)Nrf2蛋白累積并抑制膽囊癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平目的:研究在正常條件下和氧化應(yīng)激狀態(tài)下aPKCι對(duì)膽囊癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的調(diào)節(jié)作用,初步探討aPKCι與Nrf2蛋白表達(dá)的相關(guān)性。方法:構(gòu)建aPKCι過(guò)表達(dá)和靶向沉默的慢病毒載體,分別感染膽囊癌細(xì)胞NOZ和GBC-SD以獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。采用western blot和qRT-PCR方法檢測(cè)各組穩(wěn)定細(xì)胞中aPKCι的蛋白質(zhì)和m RNA表達(dá)水平。采用DCFH-DA探針?lè)z測(cè)不同aPKCι表達(dá)水平或吉西他濱處理后的膽囊癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。檢測(cè)aPKCι激酶抑制劑PSI對(duì)aPKCι活性和Nrf2蛋白水平的影響。構(gòu)建攜帶Flag標(biāo)簽的激酶失活型（KI）、持續(xù)激活的催化結(jié)構(gòu)域（CAT）突變體,采用western blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中總Nrf2蛋白和磷酸化Nrf2蛋白的表達(dá)。再運(yùn)用western blot和qRT-PCR方法檢測(cè)aPKCι對(duì)Keap1、Nrf2及其下游靶基因表達(dá)的影響。分別提取各組穩(wěn)定細(xì)胞中的漿蛋白與核蛋白,檢測(cè)aPKCι、Keap1、Nrf2蛋白在細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)的分布。在aPKCι過(guò)表達(dá)膽囊癌細(xì)胞中靶向沉... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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A-B：DCFH-DA法檢測(cè)膽囊癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化，**P<0.01

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文式—磷酸化 aPKC （p-aPKC ） 的表達(dá)水平逐漸降低，而總 aPKC （T-aPKC ）表達(dá)水平無(wú)明顯變化。此外，我們還發(fā)現(xiàn) p-Nrf2 和 T-Nrf2 亦無(wú)明顯變化。但是，Ect2—一種 aPKC 的底物[18, 19]—磷酸化水平（p-Ect2）被抑制，且總 Ect2（T-Ect2）無(wú)明顯改變。這表明本研究中 PSI 的確抑制了 aPKC 的激酶活性（圖 1-3-C）。為了進(jìn)一步證實(shí) aPKC 調(diào)控 Nrf2 蛋白富集是否與其激酶活性有關(guān)，我們構(gòu)建了攜帶 Flag 標(biāo)簽的 aPKC 野生型（wide type, WT）、激酶失活型（kinase-inactive，KI）、持續(xù)激活的催化結(jié)構(gòu)域（constitutively active catalytic domain，CAT）載體轉(zhuǎn)染至膽囊癌細(xì)胞。WB 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，WT、KI 及 CAT組細(xì)胞中p-Nrf2蛋白顯影仍然微弱且無(wú)明顯變化，而T-Nrf2蛋白則升高（圖1-3-D，E）。因此，上述結(jié)果表明 aPKC 可能以非激酶依賴(lài)的方式參與調(diào)控抗氧化反應(yīng)。

圖 1-4.A：Western blot 檢測(cè) aPKC 對(duì) Nrf2、Keap1 蛋白表達(dá)的影響。B：qRT-PCR 檢測(cè) aPKC 對(duì) Nrf2、Keap1 mRNA 表達(dá)的影響。C：Western blot 檢測(cè) aPKC 對(duì) Nrf2、Keap1 蛋白在細(xì)胞漿/核內(nèi)分布的影響。D：qRT-PCR檢測(cè)aPKC 對(duì)Nrf2靶基因mRNA水平的影響，*P<0.05，**P<0.01。5. aPKCι 通過(guò) Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激信號(hào)調(diào)控膽囊癌細(xì)胞內(nèi)的 ROS 水平接下來(lái)，我們繼續(xù)研究 aPKC 是否通過(guò) Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)調(diào)控膽囊癌細(xì)胞內(nèi) ROS 水平。首先我們篩選了敲低內(nèi)源性 Nrf2 的 siRNA 序列，并經(jīng) WB驗(yàn)證靶向沉默 Nrf2 的有效性（圖 1-5-A）。然后將陰性對(duì)照 siRNA（si-neg）與si-Nrf2 分別轉(zhuǎn)染至過(guò)表達(dá) aPKC 的膽囊癌細(xì)胞。采用 DCFH-DA 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的變化。結(jié)果顯示，抑制 Nrf2 表達(dá)后，完全逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá) aPKC 對(duì)細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的抑制作用（圖 1-5-B）。這提示 aPKC 可能是通過(guò) Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化信號(hào)通路調(diào)控膽囊癌細(xì)胞內(nèi)的 ROS 水平。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]全國(guó)膽囊癌臨床流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告[J]. 鄒聲泉,張林.  中國(guó)實(shí)用外科雜志. 2000(01)



本文編號(hào)：3316799