本文關(guān)鍵詞：熊果酸抑制NF-κB活化防治大鼠靜脈再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass graft, CABG)是治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要外科方法,也是冠狀動(dòng)脈再血管化最重要的治療手段之一。在臨床上,移植血管有動(dòng)脈和靜脈兩種,常用的有橋血管來(lái)源有乳內(nèi)動(dòng)脈、橈動(dòng)脈和大隱靜脈。乳內(nèi)動(dòng)脈是最常用的動(dòng)脈橋血管,但是其長(zhǎng)度有限。橈動(dòng)脈在應(yīng)用的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)患者無(wú)法接受的并發(fā)癥。這些都使得動(dòng)脈橋的應(yīng)用受到了很大的限制。大隱靜脈由于位置表淺,口徑較大,取材方便,兩側(cè)下肢又有足夠的長(zhǎng)度連接主動(dòng)脈與遠(yuǎn)端冠狀動(dòng)脈,多年以來(lái)使其在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用。乳內(nèi)動(dòng)脈是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)中通暢率最高的血管,隨訪資料顯示,冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)中乳內(nèi)動(dòng)脈吻合前降支,1年通暢率達(dá)95.7%,10年通暢率在90%以上,明顯優(yōu)于大隱靜脈。研究表明大隱靜脈1年內(nèi)可能發(fā)生靜脈吻合口血栓形成、近端狹窄等并發(fā)癥,1年、5年的通暢率分別為93%、74%。10年通暢率僅為50%-60%,長(zhǎng)期效果明顯不如乳內(nèi)動(dòng)脈。靜脈橋的再狹窄大大降低了手術(shù)的遠(yuǎn)期效果,對(duì)于再狹窄的發(fā)生機(jī)制仍有許多不明之處,目前認(rèn)為再狹窄可能與大隱靜脈游離過(guò)程中的損傷,術(shù)后血流動(dòng)力學(xué)的改變以及炎癥因子釋放等一系列變化,術(shù)后新生內(nèi)膜增生、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖、遷移所造成的血管重塑共同作用的結(jié)果。術(shù)后較高的再狹窄發(fā)生率已經(jīng)成為影響自體靜脈在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后中遠(yuǎn)期療效最主要的限制因素。熊果酸(ursolic acid, UA)又名烏蘇酸、烏索酸,是廣泛存在于自然界中的α-香樹(shù)脂醇型五環(huán)三萜類(lèi)化合物,分子式為C30H48O3,通常以游離或與糖結(jié)合成苷的形式存在,分布于自然界中約7個(gè)科46個(gè)屬62種植物中。熊果酸是脂溶性物質(zhì),可穿透細(xì)胞膜起效。實(shí)驗(yàn)證明熊果酸具有廣泛的生物學(xué)活性,包括抗細(xì)胞突變、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用。目前,熊果酸抗腫瘤機(jī)制已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。同時(shí),熊果酸保護(hù)心腦血管等藥理作用已經(jīng)被廣泛證實(shí)。跟心血管相關(guān)的生物學(xué)活性包括舒張血管、上調(diào)一氧化氮合酶、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。在胰島素抵抗的鼠高血壓模型中,顯示出具有抗高血壓、減慢心率、抗高血脂和抗高血糖的作用。目前對(duì)熊果酸的藥理作用機(jī)制研究較多,對(duì)心血管的作用主要有抗動(dòng)脈粥樣硬化,抑制新生血管,抗氧化及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。研究顯示熊果酸能通過(guò)抑制NF-κB的活化。NF-κB是介導(dǎo)炎癥及免疫反應(yīng)的中心物質(zhì),同時(shí)也是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,幾乎存在于所有的細(xì)胞中,其靶基因包括免疫相關(guān)受體、細(xì)胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、 IL-12和TNF-α、LTα、 LTβ、GM-CSF)、炎癥因子(MIP-1α、MCP-1)、粘附分子(ICAM、VCAM、E-selectin)急性期蛋白(如SSA)等。NF-κB主要通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng),NF-κB可以促進(jìn)各種炎癥因子和細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄,這些炎癥因子和細(xì)胞因子又可以反過(guò)來(lái)激活NF-κB,這種正反饋的效應(yīng)進(jìn)一步放大了炎癥反應(yīng)。對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增生、凋亡的影響而在再狹窄的過(guò)程中起著重要的作用。抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可為靜脈橋再狹窄防治提供新的治療靶點(diǎn)。靜脈移植動(dòng)物模型是研究冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后再狹窄的主要方法,既可以研究靜脈橋的病理變化、發(fā)病機(jī)制,又可以用于檢驗(yàn)干預(yù)措施是否有效。目前研究移植靜脈橋再狹窄的動(dòng)物模型有豬、犬等大動(dòng)物,也有大鼠、兔子等小動(dòng)物。大動(dòng)物操作相對(duì)簡(jiǎn)單,但所需費(fèi)用較高。小動(dòng)物價(jià)格便宜,易于飼養(yǎng)及管理。但由于其血管直徑小,吻合操作困難,需要具備血管吻合相關(guān)技能的人員參與操作。實(shí)驗(yàn)性自體靜脈移植模型多種多樣,血管橋主要為頸外靜脈和大隱靜脈,移植部位多在頸動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈或股動(dòng)脈。有研究表明,影響移植物早期再狹窄的主要原因是吻合技術(shù)和血栓形成。在靜脈橋再狹窄模型的建立過(guò)程中血管吻合方法主要有連續(xù)縫合、間斷縫合和Cuff套管法。目前國(guó)內(nèi)外研究再狹窄的動(dòng)物模型中關(guān)于大鼠血管移植模型的報(bào)道相對(duì)較少,主要是采用顯微外科縫合方法。因其需要精巧的顯微外科技術(shù)和很扎實(shí)的外科基本功,手術(shù)中操作空間小,常常因血管暴露不清造成誤縫或管壁撕裂,而導(dǎo)致吻合口出血和狹窄。因此改進(jìn)靜脈移植模型,提高近期通暢率,減少手術(shù)操作本身對(duì)血管的損傷對(duì)延長(zhǎng)大鼠術(shù)后存活時(shí)間十分必要。本實(shí)驗(yàn)總共分為三部分,實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱搜芯啃芄釋?duì)大鼠靜脈再狹窄的影響及機(jī)制,同時(shí)研究Cuff套管技術(shù)在大鼠靜脈再狹窄模型中的應(yīng)用。(1)兩種自體靜脈移植再狹窄大鼠模型的對(duì)比研究：利用大鼠頸外靜脈作為橋血管,分別將頸外靜脈移植至頸總動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈。建立兩種自體靜脈再狹窄大鼠模型。將兩種模型建立過(guò)程和靜脈橋內(nèi)膜和中膜的狹窄情況進(jìn)行對(duì)比研究。研究?jī)煞N動(dòng)物模型在模型建立過(guò)程及建立后靜脈橋狹窄情況的異同。(2)熊果酸在大鼠自體靜脈移植再狹窄模型中抑制血管橋增生狹窄的實(shí)驗(yàn)研究：將大鼠的頸外靜脈用Cuff吻合法移植至頸總動(dòng)脈,建立大鼠靜脈橋再狹窄的動(dòng)物模型。設(shè)立對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組大鼠給予兩種不同劑量的熊果酸,研究不同劑量的熊果酸對(duì)靜脈橋不同時(shí)期內(nèi)膜、中膜增生的抑制作用,細(xì)胞增生及凋亡的影響。(3)熊果酸在大鼠自體靜脈移植再狹窄模型中抑制血管炎癥的實(shí)驗(yàn)研究：將大鼠的頸外靜脈用Cuff吻合法移植至頸總動(dòng)脈,建立大鼠靜脈橋再狹窄的動(dòng)物模型。予以熊果酸抑制NF-κB的活化,檢測(cè)靜脈橋炎癥反應(yīng)過(guò)程中MCP-1、 IL-1α、IL-6及TNF-α的變化,研究熊果酸抑制靜脈再狹窄作用機(jī)制。研究方法(1)將30只大鼠隨機(jī)分成A、B共2組,每組15只。術(shù)前對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠禁食8小時(shí),禁水4小時(shí)。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈,以Cuff套管法為吻合方法,A組將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動(dòng)脈,B組移植至腹主動(dòng)脈,分別建成兩種自體靜脈再狹窄的動(dòng)物模型。術(shù)后滿第1周、第2周和第4周分三次取材,每次隨機(jī)選取5只大鼠。麻醉后從原切口找到靜脈橋,觀察橋靜脈通暢后切取靜脈。取下后用生理鹽水沖洗,4%多聚甲醛沖洗固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片厚度為4μm。隨機(jī)選取5個(gè)不同位置的切片做HE染色,計(jì)算內(nèi)膜、中膜厚度。(2)將45只大鼠隨機(jī)分成A、B、C共3組,每組15只。術(shù)前對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠禁食8小時(shí),禁水4小時(shí)。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈,以Cuff套管法為吻合方法,將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動(dòng)脈。A組為對(duì)照組,在靜脈移植至頸總動(dòng)脈后不予藥物干預(yù),B組術(shù)后第一天開(kāi)始予以15mg/(kg.d)熊果酸灌胃,C組術(shù)后第一天開(kāi)始予以30mg/(kg.d)熊果酸灌胃。在術(shù)后滿第1周、第2周和第4周分三次取出靜脈橋標(biāo)本,每次每組隨機(jī)選取5只大鼠,麻醉后從原切口找到靜脈橋,觀察橋靜脈通暢后切取靜脈。切片厚度為4μm。對(duì)靜脈橋切片行HE染色、Masson染色、PCNA染色、TUNEL檢測(cè)。研究不同劑量的熊果酸對(duì)靜脈橋不同時(shí)期內(nèi)膜、中膜增生的抑制作用,細(xì)胞增生及凋亡的影響。(3)將45只大鼠隨機(jī)分成A、B、C共3組,每組各15只。A組為對(duì)照組,不作任何處理。B組為模型組,將頸外靜脈移植至頸總動(dòng)脈后不予藥物干預(yù)。C組為熊果酸組,將右側(cè)頸外靜脈移植至頸總動(dòng)脈后術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始予以30mg/(kg.d)熊果酸灌胃。B、C組大鼠術(shù)前禁食8小時(shí),禁水4小時(shí)。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈,以Cuff套管法為吻合方法,將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動(dòng)脈。B、C組分別在術(shù)后第48h處死大鼠切取移植靜脈,A組取右側(cè)頸外靜脈,采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞因子MCP-1、 IL-1α、IL-6及TNF-α。對(duì)比研究3組靜脈細(xì)胞因子的含量。研究結(jié)果(1)兩組大鼠共30只全部成活,術(shù)后活動(dòng)、飲食均正常,切口愈合良好。取材時(shí)共30條橋靜脈均通暢,搏動(dòng)良好。兩組大鼠手術(shù)過(guò)程順利。B組手術(shù)時(shí)間、吻合時(shí)間均較A組長(zhǎng),兩組相比P0.05,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組大鼠隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng),內(nèi)膜和中膜的厚度也逐漸增厚。B組大鼠在1W、2W和4W不同的時(shí)間點(diǎn),內(nèi)膜和中膜的厚度分別與A組相比較,P0.05。差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)隨著時(shí)間的延長(zhǎng),所有靜脈橋的內(nèi)膜和中膜的厚度均有逐漸增厚的趨勢(shì)。兩種劑量的熊果酸對(duì)內(nèi)膜和中膜的增厚均有不同程度的抑制作用。相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)不管是內(nèi)膜還是中膜的厚度,B組與A組相比P0.05,C組與A組相比P0.05,C組與B組相比P0.05。本實(shí)驗(yàn)表明,每天給予的熊果酸劑量不同,對(duì)血管增生的抑制效果也不同。30mg/(kg.d)的熊果酸比15mg/(kg.d)具有更好的抑制內(nèi)膜和中膜增生的效果。3組靜脈橋在不同的時(shí)間所取的標(biāo)本內(nèi)膜和中膜均能見(jiàn)到PCNA陽(yáng)性細(xì)胞,兩種不同濃度的熊果酸均具有抑制細(xì)胞增殖的作用。相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖指數(shù),B組與A組相比P0.05,C組與A組相比P0.05,C組與B組相比P0.05。本研究表明,30mg/(kg.d)的熊果酸較15mg/(kg.d)具有更好的抑制內(nèi)膜和中膜細(xì)胞增殖的效果。3組靜脈橋在不同的時(shí)間所取的標(biāo)本內(nèi)膜和中膜均能見(jiàn)到凋亡細(xì)胞。相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)膜細(xì)胞凋亡指數(shù),B組與A組相比P0.05,C組與A組相比P0.05,C組與B組相比P0.05。本研究表明,30mg/(kg.d)的熊果酸比15mg/(kg.d)具有更好的誘導(dǎo)內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的效果。兩種不同濃度的熊果酸均具有誘導(dǎo)內(nèi)膜細(xì)胞增殖的作用。相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)中膜細(xì)胞凋亡指數(shù)B組與A組相比P0.05,C組與A組相比P0.05,C組與B組相比P0.05。本研究表明,30mg/(kg.d)和15mg/(kg.d)的熊果酸并沒(méi)有誘導(dǎo)中膜細(xì)胞凋亡的作用。(3)B組和C組細(xì)胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α均較A組顯著增高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在術(shù)后應(yīng)用熊果酸組治療的C組較未予熊果酸的B組細(xì)胞因子MCP-1、 IL-1α、IL-6及TNF-顯著降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論(1)兩種模型均為目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中為反映冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后移植靜脈再狹窄病理過(guò)程所用的理想模型。Cuff套管法建立大鼠頸外靜脈移植到頸總動(dòng)脈模型,操作簡(jiǎn)單,成功率高,死亡率低,短期內(nèi)無(wú)免疫排斥反應(yīng),有利于開(kāi)展大規(guī)模的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。此模型是研究移植靜脈內(nèi)膜增生和狹窄的發(fā)病機(jī)制、病理變化及探討其防治措施理想的動(dòng)物模型。(2)熊果酸能夠抑制靜脈移植后的再狹窄。劑量為30mg/(kg.d)的熊果酸比15mg/(kg.d)具有更好的抑制內(nèi)膜和中膜增殖的效果。劑量為30mg/(kg.d)的熊果酸比15mg/(kg.d)具有更好的誘導(dǎo)內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的效果。但30mg/(kg.d)和15mg/(kg.d)的熊果酸并沒(méi)有誘導(dǎo)中膜細(xì)胞凋亡的作用。(3)在移植靜脈再狹窄的模型中,各種因素導(dǎo)致血管的炎癥,進(jìn)而引起血管壁重塑是靜脈再狹窄最重要的原因。熊果酸能夠抑制靜脈移植后血管壁的炎癥,有效防治靜脈的再狹窄。熊果酸的作用機(jī)制是通過(guò)抑制NF-κB的活化,抑制了MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α基因表達(dá)。術(shù)后早期應(yīng)用抑制血管炎癥的藥物可以有效防治靜脈的再狹窄。
【關(guān)鍵詞】：熊果酸 靜脈橋 內(nèi)膜增生 再狹窄 疾病模型
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R543.6
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 兩種自體靜脈移植再狹窄大鼠模型的對(duì)比研究18-39
• 1.1 前言18-19
• 1.2 材料與方法19-23
• 1.3 結(jié)果23-29
• 1.4 討論29-34
• 1.5 結(jié)論34
• 1.6 參考文獻(xiàn)34-39
• 第二章 熊果酸在大鼠自體靜脈移植再狹窄模型中抑制血管橋再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究39-72
• 2.1 前言39-40
• 2.2 材料與方法40-49
• 2.3 結(jié)果49-62
• 2.4 討論62-67
• 2.5 結(jié)論67
• 2.6 參考文獻(xiàn)67-72
• 第三章 熊果酸在大鼠自體靜脈移植再狹窄模型中抑制血管炎癥的實(shí)驗(yàn)研究72-88
• 3.1 前言72-74
• 3.2 材料與方法74-77
• 3.3 結(jié)果77-78
• 3.4 討論78-84
• 3.5 結(jié)論84
• 3.6 參考文獻(xiàn)84-88
• 綜述一 熊果酸藥理作用的研究進(jìn)展88-100
• 參考文獻(xiàn)94-100
• 綜述二 冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后靜脈橋狹窄病因及基因治療的研究100-113
• 參考文獻(xiàn)106-113
• 英文縮略詞一覽表113-115
• 在讀期間發(fā)表論文115-116
• 致謝116-118
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明118

  本文關(guān)鍵詞：熊果酸抑制NF-κB活化防治大鼠靜脈再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：327018