發(fā)布時(shí)間：2021-03-31 06:24

　　目的:穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide）是從常用的中藥穿心蓮中提取的二萜內(nèi)酯類化合物,具有廣泛的生物活性。為了更貼近于臨床,起到老藥新用的目的,本課題擬通過(guò)對(duì)穿心蓮內(nèi)酯抗炎活性及作用機(jī)制的更深入研究,發(fā)現(xiàn)新的抗炎靶點(diǎn),并為抗炎藥物的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法:采用MTT法比較不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞存活率的影響。使用穿心蓮內(nèi)酯預(yù)處理巨噬細(xì)胞后,再用LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),運(yùn)用Griess法和Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)一氧化氮（NO）及其相關(guān)蛋白i NOS和COX-2表達(dá)水平;采用ELISA和RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞因子的產(chǎn)生量和分泌量;采用WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-?B,MAPK以及上游信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平;運(yùn)用細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穿NF-?B和AP-1核轉(zhuǎn)位情況。利用細(xì)胞內(nèi)信號(hào)陣列實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中與炎癥、代謝、凋亡等相關(guān)信號(hào)通路上的一些特異性標(biāo)志蛋白的作用;選用AMPK激活劑AICAR和抑制劑Compound C與穿心蓮內(nèi)酯對(duì)AMPK/NF-?B/MAPK信號(hào)通路中蛋白水平的影響相比較。運(yùn)用si RNA轉(zhuǎn)染方法AM... 

【文章來(lái)源】：上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市

【文章頁(yè)數(shù)】：118 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

穿心蓮內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞存活率的影響

上海中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文14RAW264.7和BMDM1h后，加入LPS刺激24h，然后，通過(guò)NO實(shí)驗(yàn)（Griess法）檢測(cè)細(xì)胞上清中的NO濃度，計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NO產(chǎn)生的抑制率。結(jié)果如圖2A和C所示，在RAW264.7和BMDM細(xì)胞中與DMSO組相比，穿心蓮內(nèi)酯能成濃度依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生，且在RAW264.7細(xì)胞10μM具有顯著性差異。其次，采用免疫印跡分析法(WB)檢測(cè)了穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NO生成相關(guān)的iNOS和COX-2蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果如圖2B和D，穿心蓮內(nèi)酯可以顯著地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7和BMDM細(xì)胞中iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)水平，且具有濃度依賴性，結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。圖2.穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NO的產(chǎn)生和相關(guān)蛋白的表達(dá)的作用穿心蓮內(nèi)酯處理RAW264.7(A,B)和BMDM(C,D)1h后，加入LPS刺激24h，然后取上清檢測(cè)NO濃度(A,C),并取細(xì)胞蛋白檢測(cè)iNOS和COX-2蛋白表達(dá)(B,D)。采用ImageJ軟件定量蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，β-actin作為內(nèi)參蛋白。所有結(jié)果三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以“平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)”表示。##P<0.01，###P<0.001表示該組與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，***P<0.001表示該組與LPS組或LPS+IFN-組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fig2.EffectsofAndroonNOproductionanditsrelatedproteinexpressionRAW264.7cells(A,B)andBMDMs(C,D)werepretreatedwithAndrofor1h,followedbytreatmentwithLPS(1μg/mL)for24h.Afterthentheculturesupernatant

上海中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文16圖3.穿心蓮內(nèi)酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的影響不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(1、10M)加入RAW264.7細(xì)胞中作用1h，LPS刺激12h后，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6(A)、TNF-(C)和IL-1(E)的濃度；LPS作用6h后，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IL-6(B)、TNF-(D)和IL-1(F)的mRNA變化。所有結(jié)果為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以“平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)”表示。##P<0.01，###P<0.001表示該組與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001表示該組與LPS組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fig3.EffectsofAndroonLPS-inducedproinflammatorycytokinesRAW264.7cellswerepretreatedwithAndro(1,10μM)for1h,followedbytreatmentwithLPSfor6h(forPCR)andfor12h(forELISA).Theproduction(A,C,E)ofIL-6,TNF-andIL-1weremeasuredbyELISA,themRNAlevels(B,D,F)ofthemweredetectedbyPCR.Allresultsareshownasmean±SEMofthreeindependentexperiments.##P<0.01，###P<0.001,comparedtonon-treatedgroup.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,comparedtoLPS-treatedgroup.3.4穿心蓮內(nèi)酯抑制NF-B信號(hào)通路的激活NF-B是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過(guò)刺激因子被活化以后，參與產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子。由LPS等多種刺激因素刺激后，IKK復(fù)合物(IKK/)通過(guò)磷酸化被激活，然后磷酸化IB導(dǎo)致IB蛋白被泛素化和溶酶體降解，NF-B被釋放出來(lái)[49,50]。我們采用WB法檢測(cè)了穿心蓮內(nèi)酯在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中對(duì)NF-B信號(hào)通路的影響。如圖4所示，穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制了IKK/和IB的磷酸化水平，同時(shí)抑制IB的降解，且其作用效果呈濃度依賴性。同時(shí)在RAW264.7、U937和BMDM細(xì)胞3種不同巨噬細(xì)胞上作用結(jié)果一致。結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NF-B通路的激活。


本文編號(hào)：3110965