本文關(guān)鍵詞：過表達(dá)CREG的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠心肌梗死的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：實(shí)驗背景:心肌梗死(myocardial infarction,MI)是常見的致死性疾病之一,即使患者度過急性期,也可能會由于成體心肌細(xì)胞的再生能力不足,使心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆的丟失,進(jìn)一步壞死心肌組織會被纖維瘢痕組織替代,最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植技術(shù)治療MI能夠有效防止病理性心室重構(gòu),增強(qiáng)心臟收縮功能,促進(jìn)心功能恢復(fù)。BMSCs移植到梗死心肌邊緣區(qū)后,可通過旁分泌多種生長因子誘導(dǎo)血管新生,從而改善梗死區(qū)微環(huán)境進(jìn)而發(fā)揮功效。因此,通過人工干預(yù)手段提高BMSCs移植后的促血管新生因子旁分泌的作用,始終是心血管病學(xué)、組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在成體組織細(xì)胞中廣泛表達(dá),但是在原始干細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,CREG可促進(jìn)其分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF);而在胚胎干細(xì)胞中,過表達(dá)CREG可促進(jìn)其向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化并形成新生血管。我們的前期體外研究也發(fā)現(xiàn),BMSCs過表達(dá)CREG后,能夠在體外對抗病理條件導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。但是,在體情況下,CREG基因修飾的BMSCs對急性MI的治療作用及機(jī)制均不清楚。因此,本研究擬通過動物體內(nèi)實(shí)驗闡明過表達(dá)CREG后BMSCs治療MI的效果并探討其機(jī)制,為防治心肌梗死提供新的治療手段和理論依據(jù)。實(shí)驗?zāi)康?1.明確過表達(dá)CREG的BMSCs移植對大鼠心肌梗死的治療作用;2.明確過表達(dá)CREG的BMSCs移植是否通過促進(jìn)旁分泌及血管新生發(fā)揮減輕MI損傷的作用;3.明確CREG是否通過上調(diào)HIF-1α促進(jìn)BMSCs的旁分泌作用。實(shí)驗方法:1.過表達(dá)CREG的BMSCs建立:利用表達(dá)CREG-GFP和GFP的腺病毒分別感染BMSCs,建立CREG過表達(dá)的BMSCs(CREGBMSCs)和感染對照組BMSCs(GFPBMSCs)。通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果,當(dāng)轉(zhuǎn)染效率達(dá)95%以上后,可用于進(jìn)行干細(xì)胞移植。2.大鼠MI模型的制備:利用2%異氟烷揮發(fā)性麻藥麻醉大鼠并固定于操作臺上,經(jīng)其左側(cè)胸骨的第4、5肋間將心臟暴露,通過結(jié)扎大鼠的心臟冠脈左前降支(left anterior desending coronary artery,LAD)建立MI模型;然后在梗死心臟邊緣區(qū)域進(jìn)行5個點(diǎn)注射治療。根據(jù)注射成分的不同將大鼠分為4組,分別是注射對照組(PBS組),普通BMSCs(NormBMSCs)治療組,GFPBMSCs治療組和CREGBMSCs治療組。3.干細(xì)胞移植治療MI后的第3天與14天,(1)利用小動物超聲測定大鼠心功能;(2)采用Masson染色檢測小鼠心肌纖維化程度;(3)利用Western blots方法檢測心肌組織中凋亡指標(biāo)cleaved Caspase-3表達(dá)水平;(4)利用ELISA方法檢測心肌組織中VEGF的表達(dá)水平;(5)通過共聚焦顯微鏡觀察心肌組織中CD31的表達(dá)水平;4.體外模擬缺氧環(huán)境,通過ELISA方法檢測過表達(dá)CREG對BMSCs的旁分泌生長因子影響,同時采用Matrigel方法觀察其對血管新生的影響。5.通過Western blot方法以及Real-time PCR方法來,探討體外缺氧條件下CREG調(diào)控BMSCs旁分泌的分子機(jī)制。實(shí)驗結(jié)果:1.體內(nèi)部分(1)過表達(dá)CREG的BMSCs治療組(CREGBMSCs)的大鼠第3天與第14天的射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)和短軸縮短率(fractional shortening,FS)比PBS組、NormBMSCs治療組以及GFPBMSCs治療組均有明顯的改善。這一結(jié)果表明,CREG過表達(dá)可提高BMSCs移植治療MI的效果,使心功能得到進(jìn)一步的改善。(2)CREGBMSCs治療組的大鼠心臟纖維化面積明顯少于PBS組、NormBMSCs治療組和GFPBMSCs治療組。這一結(jié)果表明,CREG過表達(dá)的BMSCs移植治療可進(jìn)一步減少心肌纖維化的發(fā)生,從而延緩心室重構(gòu)。(3)無論在3天還是14天時間點(diǎn),CREGBMSCs治療組的大鼠心肌凋亡指標(biāo)cleaved Caspase-3表達(dá)水平明顯低于其他3組。這一結(jié)果表明,CREG過表達(dá)BMSCs移植治療可以進(jìn)一步減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。(4)無論在3天還是14天時間點(diǎn),CREGBMSCs治療組的大鼠心臟的血管新生都明顯多于其他3組。這一結(jié)果表明,CREG過表達(dá)BMSCs移植治療可進(jìn)一步促進(jìn)血管新生,從而改善梗死區(qū)微環(huán)境。(5)過表達(dá)CREG能夠延緩移植后BMSCs的凋亡,同時延長VEGF的旁分泌作用。2.體外部分(1)體外缺氧條件下,CREG過表達(dá)可以促進(jìn)BMSCs分泌VEGF;培養(yǎng)CREGBMSCs的上清液可以促進(jìn)體外內(nèi)皮細(xì)胞血管網(wǎng)的形成。(2)CREG促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位。(3)通過HIF-1α的si RNA抑制實(shí)驗證實(shí),CREG通過調(diào)控HIF-1α促進(jìn)VEGF分泌,進(jìn)而促進(jìn)血管新生。(4)過表達(dá)CREG降低VHL(降解HIF-1α的主要分子)m RNA合成,繼而上調(diào)HIF-1α。實(shí)驗結(jié)論:1.過表達(dá)CREG的BMSCs移植治療能夠進(jìn)一步提高BMSCs改善MI心功能,同時減少纖維化和心肌凋亡發(fā)生的作用;2.過表達(dá)CREG的BMSCs其旁分泌VEGF及促血管新生的作用進(jìn)一步增強(qiáng);3.CREG通過減少調(diào)控HIF-1α降解的VHL的m RNA合成使HIF-1α表達(dá)增加,進(jìn)而上調(diào)VEGF分泌,促進(jìn)血管新生。
【關(guān)鍵詞】：心肌梗死 E1A激活基因阻遏子 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 缺氧誘導(dǎo)因子-1α VHL
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.22
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-29
• 第一部分 過表達(dá)CREG的BMSCS具有減輕MI損傷的作用29-42
• 1 材料29-33
• 2 方法33-35
• 3 結(jié)果35-39
• 4 討論39-42
• 第二部分CREG通過抑制BMSCS凋亡促進(jìn)旁分泌與血管新生減輕MI損傷42-55
• 1 材料42-46
• 2 方法46-48
• 3 結(jié)果48-51
• 4 討論51-55
• 第三部分CREG通過HIF-1Α/VHL途徑促進(jìn)缺氧條件下BMSCS的VEGF旁分泌55-66
• 1 材料55-57
• 2 方法57-59
• 3 結(jié)果59-62
• 4 討論62-66
• 小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-83
• 個人簡歷和研究成果83-85
• 致謝85

  本文關(guān)鍵詞：過表達(dá)CREG的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠心肌梗死的作用及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：300349