慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一組起源于骨髓造血干細(xì)胞的惡性增殖性血液系統(tǒng)腫瘤,其主要致病機(jī)制是9號(hào)染色體上的abl基因和22號(hào)染色體上的bcr基因斷裂易位形成bcr-abl融合基因,該基因可以持續(xù)編碼具有強(qiáng)烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,從而形成嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大疾病。酪氨酸激酶抑制劑如伊馬替尼、達(dá)沙替尼等可特異性的抑制BCR-ABL酪氨酸激酶活性,使慢性髓系白血病的治療取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。然而,仍然有部分CML惡性克隆殘留在病人體內(nèi),從而導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥。還有一部分患者對(duì)于酪氨酸激酶抑制劑存在不耐受的情況。因此,急需探索一種全新的治療方法。目前,免疫療法在腫瘤治療中受到廣泛關(guān)注。bcr-abl編碼的BCR-ABL融合蛋白是慢性髓系白血病的遺傳學(xué)標(biāo)志,其抗原特異性限定在融合位點(diǎn)內(nèi)。來(lái)源于BCR-ABL融合位點(diǎn)的抗原肽段GFKQSSKAL(GF),SSKALQRPV(SS)可以被MHC I類(lèi)分子特異性遞呈于CML細(xì)胞表面,因此該序列可以作為CML特異性抗原,是非常理想的免疫治療理想靶標(biāo)。已有研究證實(shí),通過(guò)這些抗原負(fù)載DC,將外源性抗原遞呈給CD8~+T淋巴細(xì)胞可以誘導(dǎo)CML特異性CTL應(yīng)答。但由于外源性抗原經(jīng)DC遞呈效率不高,導(dǎo)致治療效果不顯著。因此,如何增強(qiáng)DC提呈外源性抗原的效率,提高CML治療效果迫在眉睫。胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(Cytoplasmic transduction peptide,CTP)是一種具有高效細(xì)胞胞質(zhì)定位能力的肽段,包含11個(gè)氨基酸殘基。這為外源性抗原的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞核提供了可能性。在本研究中,我們運(yùn)用胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)能力,介導(dǎo)外源性BCR-ABL來(lái)源抗原肽段定位于DC胞質(zhì)中,使外源性抗原內(nèi)源化,經(jīng)由MHC I類(lèi)分子遞呈至CD8~+T淋巴細(xì)胞,形成CML特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL),從而殺傷CML細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)旨在為CML免疫治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采取的主要研究方法是:1.多肽的設(shè)計(jì)與合成及其定位效應(yīng)觀察。通過(guò)文獻(xiàn)查閱,選擇合適的BCR-ABL蛋白融合位點(diǎn)來(lái)源的抗原多肽,與改造后的CTP共同合成。體外培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞,將合成肽段與鼠源DC共同培養(yǎng),通過(guò)直接熒光觀測(cè)篩選出最佳肽段轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間。之后,通過(guò)免疫熒光和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)來(lái)觀測(cè)合成肽段在DC中的定位情況,以探究合成的CTP肽段是否具有高效的胞質(zhì)定位功能。2.CTP融合抗原對(duì)DC細(xì)胞毒性以及激發(fā)抗原交叉提呈效應(yīng)的觀察。用兩段CTP融合肽段與DC分別以不同濃度共孵育不同時(shí)間,通過(guò)CCK-8來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的活力。用CTP-GF,CTP-SS,GF,SS分別以最佳濃度與DC共孵育,之后與新鮮提取CD8~+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)對(duì)IL-2分泌量進(jìn)行測(cè)定。3.CTP融合肽段介導(dǎo)免疫應(yīng)答效能及其對(duì)BP210殺傷效應(yīng)檢測(cè)。設(shè)置CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,BLANK各實(shí)驗(yàn)組,分別將各組肽段與DC共培養(yǎng)后免疫小鼠,提取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫后小鼠淋巴細(xì)胞增殖,活化以及脫顆粒能力;酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)分析其分泌細(xì)胞因子能力;乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)(Lactate dehydrogenase release assay,LDH release assay)檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力。4.CTP融合肽段對(duì)BP210細(xì)胞致小鼠白血病的免疫治療效應(yīng)和免疫記憶效應(yīng)。先將BP210細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射入七組小鼠體內(nèi)。一周后將CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,Blank各組樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)腹股溝注射免疫小鼠,每周一次,共免疫兩次。記錄各組小鼠生存狀態(tài),體重稱(chēng)量以及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù);當(dāng)小鼠出現(xiàn)跛行,后肢癱瘓,精神萎靡,體重快速下降時(shí)斷頸處死,將肝脾進(jìn)行稱(chēng)重拍照;取小鼠骨髓涂片,肝脾印片,瑞氏染色檢查原始細(xì)胞浸潤(rùn)情況,免疫熒光法檢查BCR-ABL的表達(dá);將肝脾用4%多聚甲醛組織固定過(guò)夜,石蠟包埋,切片,HE染色觀察肝脾中白血病細(xì)胞浸潤(rùn)情況;同時(shí)記錄小鼠生存周期,比較存活時(shí)間。待免疫治療觀察期結(jié)束后,進(jìn)行CTP融合肽段對(duì)BP210細(xì)胞二次攻擊免疫記憶效應(yīng)驗(yàn)證。重新設(shè)置Blank組,將BP210細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射入4中實(shí)驗(yàn)組存活小鼠以及新設(shè)置Blank組小鼠體內(nèi)。觀察各組小鼠生存情況,實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法同上文。取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論如下:1.設(shè)計(jì)合成各組肽段,CTP融合肽段具有良好胞質(zhì)定位能力。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)驗(yàn)需求,我們?cè)O(shè)計(jì)出相應(yīng)肽段,并耦聯(lián)FITC,添加HA標(biāo)簽。流式結(jié)果顯示樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)成功。直接熒光觀測(cè)顯示CTP融合肽段在濃度10μmol/L,孵育30 min可達(dá)到最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。免疫熒光結(jié)果顯示CTP融合肽段具有良好的胞質(zhì)定位效能。激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明CTP的胞質(zhì)定位能力。2.CTP融合肽段具有良好生物安全性,成功刺激出交叉抗原提呈反應(yīng)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樹(shù)突狀細(xì)胞的生存不受CTP影響。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CTP融合肽段負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),IL-2分泌水平更高,說(shuō)明在此組交叉抗原提呈反應(yīng)被成功刺激出,抗原提呈效率更高。3.CTP融合肽段免疫組T淋巴細(xì)胞增殖能力、活化能力、脫顆粒能力、細(xì)胞因子分泌能力以及靶細(xì)胞殺傷效應(yīng)明顯高于其他組。經(jīng)由CTP融合肽段抗原負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞能誘導(dǎo)出更有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答,從而殺傷BP210靶細(xì)胞。4.CTP融合肽段免疫的小鼠具有更長(zhǎng)的生存時(shí)間,身體各項(xiàng)指標(biāo)維持良好,HE染色檢查肝脾骨髓檢查白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)情況明顯好于其他各對(duì)照組。CTP融合肽段免疫小鼠,可以更好地刺激出CML特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,對(duì)具有CML類(lèi)似癥狀的小鼠具有相對(duì)良好的治療效應(yīng)。同時(shí),腫瘤的二次攻擊對(duì)CTP融合肽段組小鼠并沒(méi)有影響,說(shuō)明記憶性T淋巴細(xì)胞在小鼠體內(nèi)存在,免疫記憶能力更強(qiáng)。綜上所述,我們成功利用CTP介導(dǎo)BCR-ABL蛋白來(lái)源抗原多肽定位于樹(shù)突狀細(xì)胞胞質(zhì)中,刺激樹(shù)突狀細(xì)胞交叉抗原提呈反應(yīng),將外源性抗原遞呈至CD8~+T淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)CML特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生,從而殺傷BP210靶細(xì)胞。本課題首次從交叉抗原提呈的角度出發(fā),將CTP引入慢性髓細(xì)胞白血病的免疫治療,并初步取得了較好地實(shí)驗(yàn)結(jié)果,這可能為慢性髓細(xì)胞白血病患者提供一種全新的治療策略。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類(lèi)】：R733.72
【部分圖文】：

小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)過(guò)GM-CSF和IL-4的刺激培養(yǎng)7天后,成功獲得呈現(xiàn)“毛刺樣”突起的細(xì)胞和細(xì)胞集落。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子標(biāo)志CD11c,CD86,MHC I以及MHC II,同時(shí)和新鮮骨髓細(xì)胞表面分子表達(dá)相比較,證實(shí)成功培養(yǎng)出骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞,如圖1-1(A,B),圖1-1(C,D)。2.2 CTP融合肽段最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)效率篩選

為了能夠觀察CTP融合肽段的直接熒光,我們?cè)诤铣呻亩蜰端通過(guò)Acp耦聯(lián)了FITC熒光。我們將FITC標(biāo)記的CTP融合肽段分別按照2μmol/L,4μmol/L,8μmol/L,10μmol/L,20μmol/L的濃度梯度與DC共培養(yǎng),分別于15 min,30 min,60 min時(shí)收集細(xì)胞,然后直接在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CTP融合肽段在10μmol/L的濃度條件下,與DC共培養(yǎng)30 min時(shí)觀察達(dá)到最高熒光強(qiáng)度(圖1-2)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均按照此最佳濃度進(jìn)行。2.3 CTP融合肽段定位于DC胞質(zhì)

如前言所述,已有研究者在抗原負(fù)載途徑方面進(jìn)行了探索,PTD便是其中一種。然而,PTD不僅可以定位于胞質(zhì),還可以進(jìn)入胞核,從而影響細(xì)胞生存,具有細(xì)胞毒性。因此,CTP的生物安全性需要得到驗(yàn)證,才能更好地進(jìn)行試驗(yàn)。我們將CTP融合肽段與DC共培養(yǎng),按照0μmol/L,4μmol/L,8μmol/L,16μmol/L,20μmol/L的濃度梯度分別共培養(yǎng)不同時(shí)間(0 h,24 h,48 h,72 h),用Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在不同濃度不同時(shí)間下,各組DC的存活率差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即CTP不會(huì)影響DC的生存,DC一直保持著較好的活性(圖1-4A,圖1-4B)。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,CTP具有良好的生物安全性。2.5 CTP融合肽段增強(qiáng)DC抗原交叉提呈能力
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本文編號(hào)：2892602