慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一組起源于骨髓造血干細胞的惡性增殖性血液系統(tǒng)腫瘤,其主要致病機制是9號染色體上的abl基因和22號染色體上的bcr基因斷裂易位形成bcr-abl融合基因,該基因可以持續(xù)編碼具有強烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,從而形成嚴重威脅人類健康的重大疾病。酪氨酸激酶抑制劑如伊馬替尼、達沙替尼等可特異性的抑制BCR-ABL酪氨酸激酶活性,使慢性髓系白血病的治療取得了長足進展。然而,仍然有部分CML惡性克隆殘留在病人體內(nèi),從而導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥。還有一部分患者對于酪氨酸激酶抑制劑存在不耐受的情況。因此,急需探索一種全新的治療方法。目前,免疫療法在腫瘤治療中受到廣泛關(guān)注。bcr-abl編碼的BCR-ABL融合蛋白是慢性髓系白血病的遺傳學(xué)標志,其抗原特異性限定在融合位點內(nèi)。來源于BCR-ABL融合位點的抗原肽段GFKQSSKAL(GF),SSKALQRPV(SS)可以被MHC I類分子特異性遞呈于CML細胞表面,因此該序列可以作為CML特異性抗原,是非常理想的免疫治療理想靶標。已有研究證實,通過這些抗原負載DC,將外源性抗原遞呈給CD8~+T淋巴細胞可以誘導(dǎo)CML特異性CTL應(yīng)答。但由于外源性抗原經(jīng)DC遞呈效率不高,導(dǎo)致治療效果不顯著。因此,如何增強DC提呈外源性抗原的效率,提高CML治療效果迫在眉睫。胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(Cytoplasmic transduction peptide,CTP)是一種具有高效細胞胞質(zhì)定位能力的肽段,包含11個氨基酸殘基。這為外源性抗原的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞核提供了可能性。在本研究中,我們運用胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)能力,介導(dǎo)外源性BCR-ABL來源抗原肽段定位于DC胞質(zhì)中,使外源性抗原內(nèi)源化,經(jīng)由MHC I類分子遞呈至CD8~+T淋巴細胞,形成CML特異性細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL),從而殺傷CML細胞。本實驗旨在為CML免疫治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。采取的主要研究方法是:1.多肽的設(shè)計與合成及其定位效應(yīng)觀察。通過文獻查閱,選擇合適的BCR-ABL蛋白融合位點來源的抗原多肽,與改造后的CTP共同合成。體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源樹突狀細胞,將合成肽段與鼠源DC共同培養(yǎng),通過直接熒光觀測篩選出最佳肽段轉(zhuǎn)導(dǎo)時間。之后,通過免疫熒光和激光共聚焦實驗來觀測合成肽段在DC中的定位情況,以探究合成的CTP肽段是否具有高效的胞質(zhì)定位功能。2.CTP融合抗原對DC細胞毒性以及激發(fā)抗原交叉提呈效應(yīng)的觀察。用兩段CTP融合肽段與DC分別以不同濃度共孵育不同時間,通過CCK-8來檢測細胞的活力。用CTP-GF,CTP-SS,GF,SS分別以最佳濃度與DC共孵育,之后與新鮮提取CD8~+T淋巴細胞共培養(yǎng),通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)對IL-2分泌量進行測定。3.CTP融合肽段介導(dǎo)免疫應(yīng)答效能及其對BP210殺傷效應(yīng)檢測。設(shè)置CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,BLANK各實驗組,分別將各組肽段與DC共培養(yǎng)后免疫小鼠,提取小鼠脾臟淋巴細胞。通過流式細胞術(shù)檢測免疫后小鼠淋巴細胞增殖,活化以及脫顆粒能力;酶聯(lián)免疫斑點實驗(Enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)分析其分泌細胞因子能力;乳酸脫氫酶釋放實驗(Lactate dehydrogenase release assay,LDH release assay)檢測效應(yīng)T淋巴細胞對靶細胞的殺傷能力。4.CTP融合肽段對BP210細胞致小鼠白血病的免疫治療效應(yīng)和免疫記憶效應(yīng)。先將BP210細胞通過尾靜脈注射入七組小鼠體內(nèi)。一周后將CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,Blank各組樹突狀細胞通過腹股溝注射免疫小鼠,每周一次,共免疫兩次。記錄各組小鼠生存狀態(tài),體重稱量以及外周血白細胞計數(shù);當小鼠出現(xiàn)跛行,后肢癱瘓,精神萎靡,體重快速下降時斷頸處死,將肝脾進行稱重拍照;取小鼠骨髓涂片,肝脾印片,瑞氏染色檢查原始細胞浸潤情況,免疫熒光法檢查BCR-ABL的表達;將肝脾用4%多聚甲醛組織固定過夜,石蠟包埋,切片,HE染色觀察肝脾中白血病細胞浸潤情況;同時記錄小鼠生存周期,比較存活時間。待免疫治療觀察期結(jié)束后,進行CTP融合肽段對BP210細胞二次攻擊免疫記憶效應(yīng)驗證。重新設(shè)置Blank組,將BP210細胞通過尾靜脈注射入4中實驗組存活小鼠以及新設(shè)置Blank組小鼠體內(nèi)。觀察各組小鼠生存情況,實驗檢測方法同上文。取得的實驗結(jié)果與結(jié)論如下:1.設(shè)計合成各組肽段,CTP融合肽段具有良好胞質(zhì)定位能力。根據(jù)文獻報道和實驗需求,我們設(shè)計出相應(yīng)肽段,并耦聯(lián)FITC,添加HA標簽。流式結(jié)果顯示樹突狀細胞培養(yǎng)成功。直接熒光觀測顯示CTP融合肽段在濃度10μmol/L,孵育30 min可達到最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。免疫熒光結(jié)果顯示CTP融合肽段具有良好的胞質(zhì)定位效能。激光共聚焦顯微鏡觀測結(jié)果進一步證明CTP的胞質(zhì)定位能力。2.CTP融合肽段具有良好生物安全性,成功刺激出交叉抗原提呈反應(yīng)。CCK-8實驗結(jié)果顯示樹突狀細胞的生存不受CTP影響。ELISA實驗結(jié)果顯示,CTP融合肽段負載樹突狀細胞與淋巴細胞共培養(yǎng),IL-2分泌水平更高,說明在此組交叉抗原提呈反應(yīng)被成功刺激出,抗原提呈效率更高。3.CTP融合肽段免疫組T淋巴細胞增殖能力、活化能力、脫顆粒能力、細胞因子分泌能力以及靶細胞殺傷效應(yīng)明顯高于其他組。經(jīng)由CTP融合肽段抗原負載樹突狀細胞能誘導(dǎo)出更有效的細胞免疫應(yīng)答,從而殺傷BP210靶細胞。4.CTP融合肽段免疫的小鼠具有更長的生存時間,身體各項指標維持良好,HE染色檢查肝脾骨髓檢查白血病細胞的浸潤情況明顯好于其他各對照組。CTP融合肽段免疫小鼠,可以更好地刺激出CML特異性細胞免疫應(yīng)答,對具有CML類似癥狀的小鼠具有相對良好的治療效應(yīng)。同時,腫瘤的二次攻擊對CTP融合肽段組小鼠并沒有影響,說明記憶性T淋巴細胞在小鼠體內(nèi)存在,免疫記憶能力更強。綜上所述,我們成功利用CTP介導(dǎo)BCR-ABL蛋白來源抗原多肽定位于樹突狀細胞胞質(zhì)中,刺激樹突狀細胞交叉抗原提呈反應(yīng),將外源性抗原遞呈至CD8~+T淋巴細胞,誘導(dǎo)CML特異性細胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生,從而殺傷BP210靶細胞。本課題首次從交叉抗原提呈的角度出發(fā),將CTP引入慢性髓細胞白血病的免疫治療,并初步取得了較好地實驗結(jié)果,這可能為慢性髓細胞白血病患者提供一種全新的治療策略。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R733.72
【部分圖文】：

小鼠骨髓細胞經(jīng)過GM-CSF和IL-4的刺激培養(yǎng)7天后,成功獲得呈現(xiàn)“毛刺樣”突起的細胞和細胞集落。經(jīng)流式細胞術(shù)檢測樹突狀細胞表面分子標志CD11c,CD86,MHC I以及MHC II,同時和新鮮骨髓細胞表面分子表達相比較,證實成功培養(yǎng)出骨髓來源樹突狀細胞,如圖1-1(A,B),圖1-1(C,D)。2.2 CTP融合肽段最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)效率篩選

為了能夠觀察CTP融合肽段的直接熒光,我們在合成肽段N端通過Acp耦聯(lián)了FITC熒光。我們將FITC標記的CTP融合肽段分別按照2μmol/L,4μmol/L,8μmol/L,10μmol/L,20μmol/L的濃度梯度與DC共培養(yǎng),分別于15 min,30 min,60 min時收集細胞,然后直接在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強度。實驗結(jié)果顯示,CTP融合肽段在10μmol/L的濃度條件下,與DC共培養(yǎng)30 min時觀察達到最高熒光強度(圖1-2)。后續(xù)實驗均按照此最佳濃度進行。2.3 CTP融合肽段定位于DC胞質(zhì)

如前言所述,已有研究者在抗原負載途徑方面進行了探索,PTD便是其中一種。然而,PTD不僅可以定位于胞質(zhì),還可以進入胞核,從而影響細胞生存,具有細胞毒性。因此,CTP的生物安全性需要得到驗證,才能更好地進行試驗。我們將CTP融合肽段與DC共培養(yǎng),按照0μmol/L,4μmol/L,8μmol/L,16μmol/L,20μmol/L的濃度梯度分別共培養(yǎng)不同時間(0 h,24 h,48 h,72 h),用Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細胞的存活率。實驗結(jié)果顯示,在不同濃度不同時間下,各組DC的存活率差異無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義,即CTP不會影響DC的生存,DC一直保持著較好的活性(圖1-4A,圖1-4B)。以上實驗說明,CTP具有良好的生物安全性。2.5 CTP融合肽段增強DC抗原交叉提呈能力
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本文編號：2892602