發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 05:33

　　 目的：組織蛋白酶S (CatS)通過修飾／分解各種生物活性物質(zhì)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的生物活性。目前為止,組織蛋白酶中,組織蛋白酶L和K在病理性血管再生中的作用有報(bào)道,但是CatS在血管形成,尤其在缺血性血管生成中表達(dá)及其作用尚無報(bào)道。研究CatS基因敲除是否影響缺血性血管再生及探明它的機(jī)制。本研究為尋找下肢缺血性疾病新治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。材料與方法；本研究利用制備下肢缺血模型,觀察缺血缺氧對(duì)CatS的蛋白表達(dá)及其活性變化,明確其在缺血性血管再生的作用。應(yīng)用CatS基因敲除小鼠進(jìn)一步證實(shí)通過血管再生相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的功能。在動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn),采用基因沉默／轉(zhuǎn)染、免疫組織化學(xué)染色/免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)(FACS)、骨髓移植、免疫蛋白印跡(Western Blot)、主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)(Aortic Ring Asssay)等多種檢測(cè)方法揭示CatS在缺血性血管再生中的作用。結(jié)果：1.CatS基因敲除明顯抑制缺血性血管再生反應(yīng)。用激光多普勒超聲血流儀檢測(cè)下肢血流的動(dòng)態(tài)變化。觀察到術(shù)后即刻、術(shù)后1天血流明顯下降,術(shù)后第4天開始血流逐漸恢復(fù),CatS基因敲除小鼠缺血下肢血流恢復(fù)明顯慢于正常對(duì)照組。用CD31免疫染色重點(diǎn)分析了毛細(xì)血管的形成。觀察到CatS基因敲除小鼠與正常對(duì)照組比較在缺血骨骼肌毛細(xì)血管形成明顯受阻,CatS基因敲除小鼠的毛細(xì)血管密度明顯低于正常對(duì)照組。2.組織蛋白酶S基因敲除明顯降低過氧化物酶體增殖物激活受體-γ (PPAR-y)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-Erk)、胰島素受體底物-2 (IRS-2).磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(P-Akt)、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、磷酸化內(nèi)皮一氧化氮合酶(P-eNOS)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的蛋白表達(dá)。制備下肢缺血模型第4天采集樣本,做western Blot來檢測(cè)CatS基因敲除小鼠和野生型小鼠的各種蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示：CatS基因敲除小鼠與野生型小鼠比較,缺血骨骼肌中PPAR-γ、IRS-2、P-Akt、P-Erk、P-P38MAPK、P-GSK、P-eNOS、VEGF的蛋白表達(dá)明顯降低。3.組織蛋白酶S的siRNA組細(xì)胞的浸潤(rùn)、增殖和成小管化功能減退的機(jī)制與PPARγ、p-Erk、IRS-2、p-Akt、p-p38MAPK、P-eNOS和VEGF水平的降低有關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)CatS在血管再生中的作用,利用基因沉默(siRNA),使CatS的表達(dá)降低。為了證實(shí)這一結(jié)果我們用western Blot檢測(cè)CatS和CatK的活性。結(jié)果表明：CatS的siRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,而對(duì)組織蛋白酶K的表達(dá)無明顯影響。將CatS的siRNA,轉(zhuǎn)染給人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,做western來檢測(cè)與血管再生相關(guān)的各種蛋白表達(dá)。在這圖中可以看出CatS的siRNA組的PPARγ、IRS-2、p-Akt、p-Erk、p-p38MAPK、p-GSK、p-eNOS、VEGF等與血管再生相關(guān)的蛋白表達(dá)明顯降低。觀察細(xì)胞的增殖功能結(jié)果表明：CatS的siRNA組與正常對(duì)照組比較,增殖的細(xì)胞數(shù)明顯減少。進(jìn)一步研究與血管再生相關(guān)的成小管化功能。用CatS干預(yù)的RNA組與未處理的正常對(duì)照組相比,管腔形成明顯被抑制。4. CatS基因敲除小鼠來源的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的與血管再生相關(guān)分子的蛋白以及磷酸化水平明顯低于野生型小鼠來源的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞。做western來檢測(cè)相關(guān)的蛋白,再次觀察到CatS基因敲除小鼠來源的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的PPAR-γ、IRS-2、p-Akt、p-Erk、p-P38MAPK、p-GSK、p-eNOS和VEGF的蛋白水平明顯低于野生型小鼠來源的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞。5.接受野生型小鼠骨髓移植,可以改善CatS基因敲除小鼠的血管再生功能。將野生型小鼠的骨髓,注入到CatS基因敲除的小鼠脛骨中；CatS基因敲除小鼠的骨髓注入到CatS基因敲除的小鼠脛骨中。結(jié)果顯示：野生型小鼠的骨髓與CatS基因敲除的小鼠骨髓相比明顯改善了缺血下肢血流。制備下肢缺血模型21天后,利用CD31免疫染色分析了毛細(xì)血管的形成,同樣可以看出野生型小鼠的骨髓明顯改善了毛細(xì)血管的形成。6. CatS抑制劑明顯抑制下肢血流的恢復(fù)及毛細(xì)血管的形成。用激光多普勒超聲血流儀檢測(cè)下肢血流的動(dòng)態(tài)變化。觀察到術(shù)后即刻、術(shù)后1天血流明顯下降,術(shù)后第4.天開始血流逐漸恢復(fù),CatS抑制劑小鼠缺血下肢血流恢復(fù)明顯慢于正常對(duì)照組。用CD31免疫染色重點(diǎn)分析了毛細(xì)血管的形成。觀察到CatS基因敲除小鼠與正常對(duì)照組比較在缺血骨骼肌毛細(xì)血管形成明顯受阻,CatS抑制劑小鼠的毛細(xì)血管密度明顯低于正常對(duì)照組。7. CatS抑制劑明顯影響動(dòng)脈環(huán)的微管腔的形成。利用組織蛋白酶抑制劑做了對(duì)動(dòng)脈環(huán)的微管腔形成的影響�？梢钥闯鲞x擇性抑制劑和非選擇性抑制劑,都明顯影響了動(dòng)脈環(huán)的微管腔的形成。8. CatS抑制劑影響與血管再生有關(guān)分子的蛋白及磷酸化水平的表達(dá)。選擇性CatS抑制劑組的PPAR-γ、IRS-2、p-Akt、p-Erk、 p-P38MAPK、p-GSK、p-eNOS和VEGF的蛋白以及磷酸化表達(dá)與正常對(duì)照組比較明顯降低。結(jié)論：CatS在缺血性血管再生中的作用可能是通過血管再生相關(guān)的信號(hào)蛋白對(duì)ECs/EPCs生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制起作用,并可能通過PPAR-γ和VEGF/Akt信號(hào)通路起作用。組織蛋白酶S有望成為治療缺血性心血管疾病的新的分子靶點(diǎn)。目的:組織蛋白酶K(CatlO是一個(gè)強(qiáng)有力的膠原酶參與人類和動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣硬化血管重建。本研巧測(cè)定CatK水平,并對(duì)CatK水平與CAD發(fā)病從及冠也病危險(xiǎn)因素之間的關(guān)系進(jìn)行分析。從而尋找新的、有臨床意義的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定相關(guān)的生物標(biāo)志物。材料與方法:2011年月至2012年12月期間住院的患者經(jīng)寇狀動(dòng)城造影后分為冠也病組256例和非冠也病姐129例。我們用免疫酶聯(lián)吸附法測(cè)定了組織蛋白酶K、.自動(dòng)生化分析儀測(cè)定髙密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白山化-0、糖化血紅蛋白(HbAlC)、肌酌(Cr)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等生化指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;計(jì)量資料文均數(shù)±碌準(zhǔn)差表示,組間計(jì)量資料采用t儉驗(yàn),組間計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),冠也病與危險(xiǎn)因素的關(guān)系采用多因素逐步回歸分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)。.結(jié)果:CAD患者蛋白酶K水平有明顯髙于非冠也病組(130.85 ng/InL和86.9±25.5ng/mL,p0.001),急性冠脈綜合征患者血清組織蛋白酶K水平明顯高于穩(wěn)定型也、絞痛組(137.1±26.9 ng/血和102.6±12.9 ng/.mL,p〈0.001)。隸性回歸分析表明,組織蛋白酶K含雖與高密度脂蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.29,p0.01)和與hs-CKP水平呈正相關(guān)(T=0.32,p0.01)。多因素逐步回歸分析表耽組織蛋白酶K水平是CAD的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)(優(yōu)勢(shì)比,1.76:95%置信區(qū)間,1-12至1.56;p〈0.01)。結(jié)論:本研究中發(fā)現(xiàn)冠心病病患者血清中組織蛋白酶K明顯丹高,組織蛋白酶K與CAD的存在密切相關(guān),有望成為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定相關(guān)的生物標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R541.4
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
Abbreviations
Chapter 1
    1.1 Introduction
    1.2 Materials and Methods
        1.2.1 Reagents
        1.2.2 Mice
        1.2.3 Model of hindlimb ischemia
        1.2.4 Analysis of hindlimb bloodflow
        1.2.5 Measurement of capillary density
        1.2.6 Western blotting
        1.2.7 Gelatin zymography
        1.2.8 Assay of collagenolytic activity
        1.2.9 Aorta-ring culture assay
        1.2.10 Analysis of EPCs
        1.2.11 BM transplantation
        1.2.12 Cell culture
        1.2.13 siRNA transfection protocol
        1.2.14 Cell proliferation assay
        1.2.15 Cell migration and invasion assays
        1.2.16 EC tube formation assay
        1.2.17 Statistical analysis
    1.3. Results
-/-impaired the blood flow recovery and capillary formation in response toischemia'>        1.3.1 CatS^-/-impaired the blood flow recovery and capillary formation in response toischemia
        1.3.2 Acute hypoxic stress induced Cat expression and activity
-/-attenuated the ischemic stress-induced IRS-2/PPAR-γ and VEGF-inducedErk1/2/p38MAPKsignaling activation'>        1.3.3 CatS^-/-attenuated the ischemic stress-induced IRS-2/PPAR-γ and VEGF-inducedErk1/2/p38MAPKsignaling activation
        1.3.4 CatS was necessary and sufficicnt to modulate the targeted angiogenic signalingactivation and cellular functions in ECs
        1.3.5 CatS activity was required for EPC-mediated neovascularization
+/+ BM rescued the neovascularization in CatS^-/- mice'>        1.3.6 CatS^+/+ BM rescued the neovascularization in CatS^-/- mice
        1.3.7 CatS inhibition diminished ischermia-induced neovascularization
-/- mice'>        1.3.8 Reduced inflammatory action in the CatS^-/- mice
    1.4. Discussion
    1.5. Condusions
    References
Chapter 2
    2.1. Introduction
    2.2. Materials and methods
        2.2.1 Study population and definition
        2.2.2 Laboratory examination
        2.2.3 Quantitative coronary angiogram（QCA）
        2.2.4 Statistical analysis
    2.3. Results
        2.3.1 Baseline clinical characteristics
        2.3.2 Atherosclerotic lesion location and characteristics
        2.3.3 Circulating biomarkers
        2.3.4 Independence of predictors of CAD
    2.4. Discussion
    2.5. Conclusions
    References
Review
    References
致謝
Published papers

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