自然殺傷(Naturalkiller,NK)細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤、抗病原微生物感染、妊娠和免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮重要作用。隨著免疫治療的興起,NK細(xì)胞也逐漸用于治療腫瘤、自身免疫病甚至生殖相關(guān)疾病。然而,由于對NK細(xì)胞發(fā)育分化的了解有限,NK細(xì)胞體外擴(kuò)增仍然困難。成年小鼠NK細(xì)胞由造血干細(xì)胞(haematopoietic stem cells,HSC)發(fā)育而來,經(jīng)歷共同淋巴細(xì)胞前體(common lymphoid progenitors,CLP)、pre-NK前體細(xì)胞、rNK前體細(xì)胞、未成熟NK細(xì)胞、成熟NK細(xì)胞各個階段。從CLP向pre-NK前體細(xì)胞發(fā)育是決定NK細(xì)胞譜系形成的關(guān)鍵階段。轉(zhuǎn)錄因子NFIL3決定了 CLP向NK細(xì)胞前體的發(fā)育,是調(diào)控NK細(xì)胞早期發(fā)育的關(guān)鍵因子。已有文獻(xiàn)報道NFIL3通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子TOX、EOMES、ID2的表達(dá)來促進(jìn)NK細(xì)胞的發(fā)育。但目前還沒有文獻(xiàn)報道什么分子能直接上調(diào)NFIL3。PBX1是一個在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮諸多作用的轉(zhuǎn)錄因子。造血系統(tǒng)特異性缺失PBX1的小鼠HSC穩(wěn)態(tài)被打破,更多地處于細(xì)胞分裂狀態(tài),自我更新能力受損,其CLP細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞明顯減少,但T細(xì)胞正常。T細(xì)胞與NK細(xì)胞都由CLP分化而來。因此,除了 PBX1缺陷會影響HSC自我更新之外,應(yīng)當(dāng)存在其他原因?qū)е翪LP向NK細(xì)胞發(fā)育受損。并且在NK細(xì)胞發(fā)育過程中PBX1的作用靶標(biāo)也是未知的。因此我們關(guān)注NK細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子NFIL3的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,研究轉(zhuǎn)錄因子PBX1是否可以直接調(diào)控NFIL3表達(dá)及其分子機(jī)制,獲得了如下結(jié)果:1.缺失PBX1時NK細(xì)胞早期發(fā)育受損為探究PBX1在NK細(xì)胞發(fā)育過程中的作用,我們構(gòu)建了造血系統(tǒng)特異性缺失PBX1的小鼠。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),缺失PBX1的小鼠骨髓NK細(xì)胞前體(pre-NKP和rNKP)和小鼠NK細(xì)胞比例和數(shù)目均下降,而T細(xì)胞不變。因此PBX1可能作用于CLP向NK細(xì)胞前體發(fā)育的階段。2.缺失PBX1時NK細(xì)胞表達(dá)NFIL3水平下降缺失PBX1導(dǎo)致NK細(xì)胞前體減少,這與缺失NFIL3的小鼠現(xiàn)象一致。為探究PBX1是否影響NFIL3表達(dá)水平,我們使用流式內(nèi)標(biāo)技術(shù)檢測了 PBX1條件性敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)缺失PBX1的骨髓和脾臟NK細(xì)胞內(nèi)NFIL3及其下游分子EOMES的表達(dá)量明顯下降。因此PBX1能影響NFIL3的表達(dá)。3.PBX1可以直接結(jié)合Nfil3啟動子為探究PBX1是否通過直接結(jié)合Nfil3啟動子發(fā)揮作用,我們通過生物信息學(xué)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)Nfil3啟動子區(qū)含有潛在的PBX1結(jié)合位點。通過小鼠骨髓NK細(xì)胞ChIP實驗證明NK細(xì)胞中PBX1結(jié)合了Nfil3啟動子上預(yù)測結(jié)合位點所在區(qū)域。通過螢光素酶報告實驗和DNA-pulldown實驗我們也證明了在體外PBX1能結(jié)合并活化Nf113啟動子。4.NFIL3啟動子區(qū)PBX1結(jié)合位點缺陷的小鼠NK細(xì)胞早期發(fā)育受損PBX1缺失會導(dǎo)致CLP減少,這與NFIL3缺失不一致,這一差異是由于PBX1影響造血干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。為了排除PBX1對造血干細(xì)胞的影響,我們用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除小鼠基因組Nfil3啟動子中PBX1結(jié)合位點,流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)該小鼠骨髓CLP細(xì)胞比例不變而pre-NKP和rNKP細(xì)胞比例下降,NK細(xì)胞比例下降,而T細(xì)胞、B細(xì)胞比例不變。因此當(dāng)PBX1不再調(diào)控Nfil3啟動子后,從CLP向NK細(xì)胞譜系形成發(fā)育受損。表明PBX1確實通過結(jié)合Nfil3啟動子調(diào)控NK細(xì)胞早期發(fā)育。5.PBX1結(jié)合Nfil3啟動子依賴于PBX1第286位氨基酸為了檢測PBX1蛋白上哪些氨基酸介導(dǎo)與Nfil3啟動子的結(jié)合,我們對PBX1進(jìn)行分區(qū)截短以及單個氨基酸替換突變,進(jìn)行螢光素酶報告實驗和DNA-pulldown實驗,發(fā)現(xiàn)PBX1第286位氨基酸天冬酰胺對與Nfil3啟動子的結(jié)合起關(guān)鍵作用。綜上所述,我們證明了轉(zhuǎn)錄因子PBX1可以通過其homeodoiman中第286位天冬酰胺結(jié)合Nfil3啟動子促進(jìn)NFIL3轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)NK細(xì)胞的早期發(fā)育。該課題完善了對PBX1的相關(guān)研究,并有助于了解NK細(xì)胞的發(fā)育。這也為NK細(xì)胞體外擴(kuò)增用于細(xì)胞免疫治療奠定了理論基礎(chǔ)。該研究的創(chuàng)新之處在于:(1)我們首次報道NK細(xì)胞發(fā)育過程中NFIL3上游直接調(diào)控NFIL3表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子;(2)我們完善PBX1對NK細(xì)胞發(fā)育的影響機(jī)制,PBX1調(diào)控NFIL3表達(dá)從而影響CLP向pre-NKP細(xì)胞發(fā)育;(3)我們找到PBX1蛋白中影響其結(jié)合Nfil3啟動子能力的單個氨基酸Asp286。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

?第一章緒?論???Ａ．?ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ－ｓｅｌｆ，??Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ??ＷＲ．?Ｓｅｌｆ－??遍＇＇??ＮＫｃｅｌｌ?Ｔａｒｇｅｔ?ｃｅｌｌ??‘Ｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ’??ＫＩＲ．?Ｎｏ?ｎ??，?＾ｓ�。矗�?ＭＨＣ＾?？??⑩〇心??Ｃ．?＇Ｉｎｄｕｃｅｄ－ｓｅｌｆ??Ｋ，Ｒ－?Ｓｅｌｆ－?〇??Ｈ６０??Ｄ．?＇Ｎｏｎ－ｓｅｌｆ＇??ＫＪＲ，?Ａｌｉｏ－?０??涵ＪＴ＇ｎ??Ｈ６０??圖１．１?ＮＫ細(xì)胞識別靶細(xì)胞機(jī)制??圖注：Ａ．抑制性受體（人ＫＩＲ或小鼠Ｌｙ４９）識別自身ＭＨＣ－丨類分子（人ＨＬＡ或小??鼠Ｈ２），?ＮＫ細(xì)胞識別自身正常細(xì)胞，抑制ＮＫ細(xì)胞活化；Ｂ．靶細(xì)胞不表達(dá)或者??低表達(dá)ＭＨＣ－Ｉ類分子，ＮＫ細(xì)胞活化；Ｃ．?ＮＩＣ細(xì)胞表面ＮＫＧ２Ｄ識別靶細(xì)胞表面??Ｍ１Ｃ－Ａ／ＢＣ小鼠為Ｈ６０），或小鼠ＮＫ細(xì)胞表面Ｌｙ４９Ｈ識別靶細(xì)胞表面ｍｌ５７，則??活化信號超過抑制信號，ＮＫ細(xì)胞被活化；Ｄ．當(dāng)移植的供者組織表達(dá)異源或單倍??體ＭＨＣ－Ｉ時ＮＫ細(xì)胞識別移植細(xì)胞并被活化。（引自ＡｌｅｘＭ．Ａｂｅｌ．??ｉｎ?Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．?２０１８）?４??２??

?第一章緒?論???顯減少。并且ＦＬＴ３Ｌ缺陷的ＨＳＣ在移植后所有譜系的重建能力都嚴(yán)重下降８，９。??ＦＬＴ３Ｌ缺陷小鼠的骨髓ＨＳＣ數(shù)量不變，ＣＬＰ數(shù)量下降，但ＦＬＴ３Ｌ缺陷的ＨＳＣ??在骨髓移植后分化能力不受影響ＩＧ。這與ＭＰＰ表達(dá)ＦＬＴ３，與基質(zhì)細(xì)胞上的ＦＬＴ３Ｌ??相互作用促進(jìn)分化是一致的。??／Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ?／ｔ??＼?；?＼ｉ??圖１．２骨髓中ＮＫ細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境??圖注：骨髓竇狀隙樣血管附近的低氧微環(huán)境中，激素和細(xì)胞因子誘導(dǎo)生成靜息狀態(tài)造??血干細(xì)胞。在ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ等因子刺激下，ＨＳＣ分化為ＣＬＰ。非骨髓基質(zhì)細(xì)胞（間??充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞ＭＳＣ，成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞）產(chǎn)生【Ｌ－７或［Ｌ－１５，促進(jìn)ＣＬＰ細(xì)胞分化為??不同淋巴細(xì)胞，包括ＮＫ細(xì)胞前體。ＭＳＣ也產(chǎn)生１Ｌ－２１幫助ＮＫ細(xì)胞前體擴(kuò)增。??ＣＸＣＬ１２充足的網(wǎng)狀細(xì)胞ＣＡＲ產(chǎn)生ＣＸＣＬ１２，通過細(xì)胞表面的ＣＸＣＲ４促進(jìn)ＮＫ??細(xì)胞前體或未成熟ＮＫ細(xì)胞分化為成熟ＮＫ細(xì)胞。成熟ＮＫ細(xì)胞通過竇狀隙樣血??管遷移至次級淋巴器官。其他類型細(xì)胞，周細(xì)胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ）、巨核細(xì)胞??（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ）、脂肪細(xì)胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、冠層細(xì)胞（ｃａｎｏｐｙ?ｃｅｌｌ）、成骨細(xì)胞??（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、破骨細(xì)胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）、骨細(xì)胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）也幫助形成骨髓微環(huán)境??ｎｉｃｈｅ?和支撐體系。（引自?Ａｌｅｘ?Ｍ．?Ａｂｅｌ．，ｅｔ?ａｌ．?Ｆｒａｎｈｅｒｊ１?／？?／／ｗｍｔｆｊｏ／ｏｇｙ?２０?丨?８）?４??ｃ－Ｋｉｔ缺陷小鼠ＣＬＰ數(shù)目減少，并且ｃ－ｔｏ缺陷的ＨＳＣ骨髓重建能力也明顯??下降１１。同時，

???ＨＳＣ??？?ＣＬＰ??？?ｐｒｅ－ＮＫＰ??？?ｒＮＫＰ??？?ＮＫ??ＳＣＦ?ＩＬ－１５??ＦＬＴ３Ｌ??ＣＸＣＬ１２?Ｌｉｎ－?Ｌｉｎ－?Ｌｉｎ－?Ｌｉｎ－??ＣＤ２７＋?ＣＤ２７＋?ＣＤ２７＋?ＣＤ１２２＋??ＣＤ２４４．２＋?ＣＤ２４４．２＋?ＣＤ２４４．２＋?ＮＫ１．１?＋??ＩＬ－７Ｒａ＋?ＩＬ－７Ｒａ＋?ＩＬ－７Ｒａ＋??Ｆｌｔ３＋?Ｆｌｔ３－?Ｆｌｔ３－??ＣＤ１２２－?ＣＤ１２２－?ＣＤ１２２＋??圖１．３成年小鼠骨髄ＮＫ細(xì)胞發(fā)育過程??１．２．４胸腺中的ＮＫ細(xì)胞發(fā)育??在胎兒和成年人或小鼠的胸腺中有少量ＮＫ細(xì)胞，這群ＮＫ細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)??胞活性下降，但在ＩＬ－１２刺激下胸腺ＮＫ細(xì)胞分泌細(xì)胞因子ＩＦＮ－ｙ、ＧＭ－ＣＳＦ、??ＴＮＦａ能力上升。胸腺ＮＫ細(xì)胞參與調(diào)節(jié)淋巴結(jié)中的樹突狀細(xì)胞功能以及胸腺腫??瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視。與傳統(tǒng)的骨髓依賴的ＮＫ細(xì)胞不同，胸腺ＮＫ細(xì)胞不表達(dá)??Ｌｙ４９，ＣＤｌｌｂ?和?ＣＤ４３，但表達(dá)?ＣＤＩ２７?（ｌＬ－７Ｒｃｉ），也表達(dá)?ＣＤ４９ｂ。胸腺?ＮＫ?細(xì)胞??可以出胸腺進(jìn)入外周淋巴器官。??使用譜系追蹤的方法發(fā)現(xiàn)成年小鼠胸腺中僅有小于１０％的ＮＫ細(xì)胞是表達(dá)??及ｏｒｅ的雙陽性胸腺細(xì)胞的后代，并且?guī)缀鯖]有胸腺ＮＫ細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞內(nèi)ＣＤ３ｓ。??使用ＧＦＰ報告小鼠也發(fā)現(xiàn)胸腺ＮＫ細(xì)胞不表達(dá)Ｒａｇ２，表明ＮＫ細(xì)胞不重排ＴＣＲＹ，??說明胸腺ＮＫ細(xì)胞不來源于雙陰性胸腺細(xì)胞前體。轉(zhuǎn)錄因子ＭＶｃ／ｚ在淋巴細(xì)胞前??體向Ｔ細(xì)胞譜系形成中發(fā)揮重要作用，如果胸腺ＮＫ細(xì)胞來源于早期胸腺祖細(xì)??胞（ＥＴＰ），則其發(fā)育應(yīng)依賴于Ｎｏｔｃｈ信號
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本文編號：2892503