自然殺傷(Naturalkiller,NK)細胞在機體抗腫瘤、抗病原微生物感染、妊娠和免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮重要作用。隨著免疫治療的興起,NK細胞也逐漸用于治療腫瘤、自身免疫病甚至生殖相關疾病。然而,由于對NK細胞發(fā)育分化的了解有限,NK細胞體外擴增仍然困難。成年小鼠NK細胞由造血干細胞(haematopoietic stem cells,HSC)發(fā)育而來,經(jīng)歷共同淋巴細胞前體(common lymphoid progenitors,CLP)、pre-NK前體細胞、rNK前體細胞、未成熟NK細胞、成熟NK細胞各個階段。從CLP向pre-NK前體細胞發(fā)育是決定NK細胞譜系形成的關鍵階段。轉(zhuǎn)錄因子NFIL3決定了 CLP向NK細胞前體的發(fā)育,是調(diào)控NK細胞早期發(fā)育的關鍵因子。已有文獻報道NFIL3通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子TOX、EOMES、ID2的表達來促進NK細胞的發(fā)育。但目前還沒有文獻報道什么分子能直接上調(diào)NFIL3。PBX1是一個在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮諸多作用的轉(zhuǎn)錄因子。造血系統(tǒng)特異性缺失PBX1的小鼠HSC穩(wěn)態(tài)被打破,更多地處于細胞分裂狀態(tài),自我更新能力受損,其CLP細胞、B細胞、NK細胞明顯減少,但T細胞正常。T細胞與NK細胞都由CLP分化而來。因此,除了 PBX1缺陷會影響HSC自我更新之外,應當存在其他原因?qū)е翪LP向NK細胞發(fā)育受損。并且在NK細胞發(fā)育過程中PBX1的作用靶標也是未知的。因此我們關注NK細胞核心轉(zhuǎn)錄因子NFIL3的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,研究轉(zhuǎn)錄因子PBX1是否可以直接調(diào)控NFIL3表達及其分子機制,獲得了如下結(jié)果:1.缺失PBX1時NK細胞早期發(fā)育受損為探究PBX1在NK細胞發(fā)育過程中的作用,我們構建了造血系統(tǒng)特異性缺失PBX1的小鼠。通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn),缺失PBX1的小鼠骨髓NK細胞前體(pre-NKP和rNKP)和小鼠NK細胞比例和數(shù)目均下降,而T細胞不變。因此PBX1可能作用于CLP向NK細胞前體發(fā)育的階段。2.缺失PBX1時NK細胞表達NFIL3水平下降缺失PBX1導致NK細胞前體減少,這與缺失NFIL3的小鼠現(xiàn)象一致。為探究PBX1是否影響NFIL3表達水平,我們使用流式內(nèi)標技術檢測了 PBX1條件性敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)缺失PBX1的骨髓和脾臟NK細胞內(nèi)NFIL3及其下游分子EOMES的表達量明顯下降。因此PBX1能影響NFIL3的表達。3.PBX1可以直接結(jié)合Nfil3啟動子為探究PBX1是否通過直接結(jié)合Nfil3啟動子發(fā)揮作用,我們通過生物信息學預測,發(fā)現(xiàn)Nfil3啟動子區(qū)含有潛在的PBX1結(jié)合位點。通過小鼠骨髓NK細胞ChIP實驗證明NK細胞中PBX1結(jié)合了Nfil3啟動子上預測結(jié)合位點所在區(qū)域。通過螢光素酶報告實驗和DNA-pulldown實驗我們也證明了在體外PBX1能結(jié)合并活化Nf113啟動子。4.NFIL3啟動子區(qū)PBX1結(jié)合位點缺陷的小鼠NK細胞早期發(fā)育受損PBX1缺失會導致CLP減少,這與NFIL3缺失不一致,這一差異是由于PBX1影響造血干細胞穩(wěn)態(tài)。為了排除PBX1對造血干細胞的影響,我們用CRISPR-Cas9技術敲除小鼠基因組Nfil3啟動子中PBX1結(jié)合位點,流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)該小鼠骨髓CLP細胞比例不變而pre-NKP和rNKP細胞比例下降,NK細胞比例下降,而T細胞、B細胞比例不變。因此當PBX1不再調(diào)控Nfil3啟動子后,從CLP向NK細胞譜系形成發(fā)育受損。表明PBX1確實通過結(jié)合Nfil3啟動子調(diào)控NK細胞早期發(fā)育。5.PBX1結(jié)合Nfil3啟動子依賴于PBX1第286位氨基酸為了檢測PBX1蛋白上哪些氨基酸介導與Nfil3啟動子的結(jié)合,我們對PBX1進行分區(qū)截短以及單個氨基酸替換突變,進行螢光素酶報告實驗和DNA-pulldown實驗,發(fā)現(xiàn)PBX1第286位氨基酸天冬酰胺對與Nfil3啟動子的結(jié)合起關鍵作用。綜上所述,我們證明了轉(zhuǎn)錄因子PBX1可以通過其homeodoiman中第286位天冬酰胺結(jié)合Nfil3啟動子促進NFIL3轉(zhuǎn)錄,從而促進NK細胞的早期發(fā)育。該課題完善了對PBX1的相關研究,并有助于了解NK細胞的發(fā)育。這也為NK細胞體外擴增用于細胞免疫治療奠定了理論基礎。該研究的創(chuàng)新之處在于:(1)我們首次報道NK細胞發(fā)育過程中NFIL3上游直接調(diào)控NFIL3表達的轉(zhuǎn)錄因子;(2)我們完善PBX1對NK細胞發(fā)育的影響機制,PBX1調(diào)控NFIL3表達從而影響CLP向pre-NKP細胞發(fā)育;(3)我們找到PBX1蛋白中影響其結(jié)合Nfil3啟動子能力的單個氨基酸Asp286。
【學位單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

?第一章緒?論???Ａ．?ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ－ｓｅｌｆ，??Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ??ＷＲ．?Ｓｅｌｆ－??遍＇＇??ＮＫｃｅｌｌ?Ｔａｒｇｅｔ?ｃｅｌｌ??‘Ｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ’??ＫＩＲ．?Ｎｏ?ｎ??，?＾ｓ！－ｙ４９?ＭＨＣ＾?？??⑩〇心??Ｃ．?＇Ｉｎｄｕｃｅｄ－ｓｅｌｆ??Ｋ，Ｒ－?Ｓｅｌｆ－?〇??Ｈ６０??Ｄ．?＇Ｎｏｎ－ｓｅｌｆ＇??ＫＪＲ，?Ａｌｉｏ－?０??涵ＪＴ＇ｎ??Ｈ６０??圖１．１?ＮＫ細胞識別靶細胞機制??圖注：Ａ．抑制性受體（人ＫＩＲ或小鼠Ｌｙ４９）識別自身ＭＨＣ－丨類分子（人ＨＬＡ或小??鼠Ｈ２），?ＮＫ細胞識別自身正常細胞，抑制ＮＫ細胞活化；Ｂ．靶細胞不表達或者??低表達ＭＨＣ－Ｉ類分子，ＮＫ細胞活化；Ｃ．?ＮＩＣ細胞表面ＮＫＧ２Ｄ識別靶細胞表面??Ｍ１Ｃ－Ａ／ＢＣ小鼠為Ｈ６０），或小鼠ＮＫ細胞表面Ｌｙ４９Ｈ識別靶細胞表面ｍｌ５７，則??活化信號超過抑制信號，ＮＫ細胞被活化；Ｄ．當移植的供者組織表達異源或單倍??體ＭＨＣ－Ｉ時ＮＫ細胞識別移植細胞并被活化。（引自ＡｌｅｘＭ．Ａｂｅｌ．??ｉｎ?Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．?２０１８）?４??２??

?第一章緒?論???顯減少。并且ＦＬＴ３Ｌ缺陷的ＨＳＣ在移植后所有譜系的重建能力都嚴重下降８，９。??ＦＬＴ３Ｌ缺陷小鼠的骨髓ＨＳＣ數(shù)量不變，ＣＬＰ數(shù)量下降，但ＦＬＴ３Ｌ缺陷的ＨＳＣ??在骨髓移植后分化能力不受影響ＩＧ。這與ＭＰＰ表達ＦＬＴ３，與基質(zhì)細胞上的ＦＬＴ３Ｌ??相互作用促進分化是一致的。??／Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ?／ｔ??＼?；?＼ｉ??圖１．２骨髓中ＮＫ細胞發(fā)育的微環(huán)境??圖注：骨髓竇狀隙樣血管附近的低氧微環(huán)境中，激素和細胞因子誘導生成靜息狀態(tài)造??血干細胞。在ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ等因子刺激下，ＨＳＣ分化為ＣＬＰ。非骨髓基質(zhì)細胞（間??充質(zhì)基質(zhì)細胞ＭＳＣ，成纖維網(wǎng)狀細胞）產(chǎn)生【Ｌ－７或［Ｌ－１５，促進ＣＬＰ細胞分化為??不同淋巴細胞，包括ＮＫ細胞前體。ＭＳＣ也產(chǎn)生１Ｌ－２１幫助ＮＫ細胞前體擴增。??ＣＸＣＬ１２充足的網(wǎng)狀細胞ＣＡＲ產(chǎn)生ＣＸＣＬ１２，通過細胞表面的ＣＸＣＲ４促進ＮＫ??細胞前體或未成熟ＮＫ細胞分化為成熟ＮＫ細胞。成熟ＮＫ細胞通過竇狀隙樣血??管遷移至次級淋巴器官。其他類型細胞，周細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ）、巨核細胞??（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、冠層細胞（ｃａｎｏｐｙ?ｃｅｌｌ）、成骨細胞??（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）也幫助形成骨髓微環(huán)境??ｎｉｃｈｅ?和支撐體系。（引自?Ａｌｅｘ?Ｍ．?Ａｂｅｌ．，ｅｔ?ａｌ．?Ｆｒａｎｈｅｒｊ１?／？?／／ｗｍｔｆｊｏ／ｏｇｙ?２０?丨?８）?４??ｃ－Ｋｉｔ缺陷小鼠ＣＬＰ數(shù)目減少，并且ｃ－ｔｏ缺陷的ＨＳＣ骨髓重建能力也明顯??下降１１。同時，

???ＨＳＣ??？?ＣＬＰ??？?ｐｒｅ－ＮＫＰ??？?ｒＮＫＰ??？?ＮＫ??ＳＣＦ?ＩＬ－１５??ＦＬＴ３Ｌ??ＣＸＣＬ１２?Ｌｉｎ－?Ｌｉｎ－?Ｌｉｎ－?Ｌｉｎ－??ＣＤ２７＋?ＣＤ２７＋?ＣＤ２７＋?ＣＤ１２２＋??ＣＤ２４４．２＋?ＣＤ２４４．２＋?ＣＤ２４４．２＋?ＮＫ１．１?＋??ＩＬ－７Ｒａ＋?ＩＬ－７Ｒａ＋?ＩＬ－７Ｒａ＋??Ｆｌｔ３＋?Ｆｌｔ３－?Ｆｌｔ３－??ＣＤ１２２－?ＣＤ１２２－?ＣＤ１２２＋??圖１．３成年小鼠骨髄ＮＫ細胞發(fā)育過程??１．２．４胸腺中的ＮＫ細胞發(fā)育??在胎兒和成年人或小鼠的胸腺中有少量ＮＫ細胞，這群ＮＫ細胞殺傷腫瘤細??胞活性下降，但在ＩＬ－１２刺激下胸腺ＮＫ細胞分泌細胞因子ＩＦＮ－ｙ、ＧＭ－ＣＳＦ、??ＴＮＦａ能力上升。胸腺ＮＫ細胞參與調(diào)節(jié)淋巴結(jié)中的樹突狀細胞功能以及胸腺腫??瘤細胞的免疫監(jiān)視。與傳統(tǒng)的骨髓依賴的ＮＫ細胞不同，胸腺ＮＫ細胞不表達??Ｌｙ４９，ＣＤｌｌｂ?和?ＣＤ４３，但表達?ＣＤＩ２７?（ｌＬ－７Ｒｃｉ），也表達?ＣＤ４９ｂ。胸腺?ＮＫ?細胞??可以出胸腺進入外周淋巴器官。??使用譜系追蹤的方法發(fā)現(xiàn)成年小鼠胸腺中僅有小于１０％的ＮＫ細胞是表達??及ｏｒｅ的雙陽性胸腺細胞的后代，并且?guī)缀鯖]有胸腺ＮＫ細胞表達細胞內(nèi)ＣＤ３ｓ。??使用ＧＦＰ報告小鼠也發(fā)現(xiàn)胸腺ＮＫ細胞不表達Ｒａｇ２，表明ＮＫ細胞不重排ＴＣＲＹ，??說明胸腺ＮＫ細胞不來源于雙陰性胸腺細胞前體。轉(zhuǎn)錄因子ＭＶｃ／ｚ在淋巴細胞前??體向Ｔ細胞譜系形成中發(fā)揮重要作用，如果胸腺ＮＫ細胞來源于早期胸腺祖細??胞（ＥＴＰ），則其發(fā)育應依賴于Ｎｏｔｃｈ信號
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本文編號：2892503