發(fā)布時間：2020-09-09 11:07

　　 研究背景:疾病的發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果,以單靶點開發(fā)的西藥往往局限于某一方面而療效欠佳,中藥的優(yōu)勢和特色則在于多靶同治。千百年來,我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)以神農(nóng)嘗百草的方式創(chuàng)建了中藥復(fù)雜體系網(wǎng)絡(luò)綜合作用的模式,這種模式也得到了西方醫(yī)學(xué)的效仿,也逐漸采用多藥聯(lián)合的綜合治療。然而與西藥相比,中藥方劑最大的問題在于“盲法”治療,藥效物質(zhì)不清,作用靶點不清,配伍的科學(xué)內(nèi)涵不清,嚴(yán)重阻礙了中藥的國際化進程。近年來有學(xué)者認(rèn)為:中藥復(fù)方中的有效成分組方應(yīng)用能針對性的提高療效,降低不良反應(yīng),將成為中藥治療指標(biāo)的新模式。精簡復(fù)方組成,摒棄不必要的多余成分,有利于促進中藥內(nèi)涵現(xiàn)代化。因此,尋找復(fù)方中的藥效物質(zhì)成分,利用分子生物學(xué)的分子靶點和檢測技術(shù),揭示中藥方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵,對傳承和弘揚中醫(yī)藥精髓,促進其國際化進程具有十分重要的研究意義。中醫(yī)理論認(rèn)為“萬病之惡在于瘀”。瘀阻在心,則誘發(fā)心肌缺血;瘀阻在腎,則造成腎臟缺血。心肌缺血的治療往往繼發(fā)性出現(xiàn)致死性再灌注,因此MI/R損傷日益受到高度關(guān)注。中醫(yī)學(xué)家認(rèn)為該病的病機為本虛標(biāo)實,氣血運行不利,瘀血內(nèi)阻于心,歷代醫(yī)家主張采用“活血化瘀”的主要治則;腎臟缺血造成組織灌注不足,長期缺血導(dǎo)致CKI,在中醫(yī)學(xué)將其歸于癃閉、關(guān)格等范疇,血瘀兼證是最常見的證候,其病機特點為氣滯血瘀、濁毒內(nèi)生,因此傳統(tǒng)中醫(yī)藥始終堅持以“活血化瘀、泄?jié)崤哦尽睘橹饕蝿t�？梢姛o論是MI/R,還是CKI,活血化瘀是根本治則。千百年來,傳統(tǒng)中醫(yī)藥在血瘀導(dǎo)致的疾病治療中發(fā)揮了十分重要的作用。丹參是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥,與丹參配伍應(yīng)用的對藥有很多。例如丹參與紅花配伍制成的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑丹紅注射液(danhong injection,DHI)主要用于心腦血管疾病的治療。又如丹參與大黃配伍為主要成分的中藥方劑和中成藥有數(shù)十種(如:腎康注射液、腎衰寧膠囊、尿毒清顆粒等),主要用于慢性腎病的治療。然而迄今,丹參對藥配伍的科學(xué)內(nèi)涵不清,對心肌保護或腎臟保護的分子作用機制不明,這嚴(yán)重阻礙了有效方劑的質(zhì)量提升和二次開發(fā)。故闡明丹參對藥配伍的藥效物質(zhì)及作用機制,對中藥大品種質(zhì)量提升、傳承和弘揚中醫(yī)藥理論精髓、促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化進程具有十分重要的科學(xué)研究意義。本研究以丹參-紅花對藥用于MI/R損傷和丹參-大黃對藥用于CKI為切入點,尋找和驗證其中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),闡明保護作用的分子機制,揭示對藥作用的科學(xué)內(nèi)涵,為中藥復(fù)方藥效物質(zhì)和作用機制的研究提供參考。研究目的:第一部分:丹參-紅花對藥改善MI/R損傷的藥效物質(zhì)及作用機制1.篩選丹參和紅花配伍制成的中藥復(fù)方制劑DHI中發(fā)揮心肌保護的藥效物質(zhì),并進行反饋驗證。2.明確DHI及藥效物質(zhì)抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡的心肌保護作用。3.證實DHI及藥效物質(zhì)通過激活再灌注損傷補救激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)信號通路發(fā)揮改善MI/R損傷的機制。第二部分:丹參-大黃對藥改善CKI的藥效物質(zhì)及作用機制1.篩選丹參和大黃中發(fā)揮腎保護的藥效物質(zhì),并進行反饋驗證。2.明確丹參素和大黃酸聯(lián)用抗纖維化、抗炎和抗凋亡的腎保護作用。3.探討Sirt3/FOXO3a通路在丹參素和大黃酸聯(lián)用發(fā)揮改善CKI的機制。研究方法:第一部分:丹參-紅花對藥改善MI/R損傷的藥效物質(zhì)及作用機制1.藥效物質(zhì)篩選:建立體外模擬缺血/再灌注(simulated ischemia/reperfusion,SI/R)損傷的心肌細(xì)胞模型,將丹參和紅花中主要成分丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、原兒茶醛、迷迭香酸、羥基紅花黃色素A、紅花苷分別給予模型細(xì)胞,MTT法檢測細(xì)胞存活率,ELISA法檢測細(xì)胞CK-MB和LDH釋放量,篩選丹參-紅花配伍制成的DHI中發(fā)揮心肌保護作用的候選藥效物質(zhì)。2.候選藥效物質(zhì)反饋驗證:將候選藥效物質(zhì)分別或組合給予MI/R損傷大鼠,監(jiān)測心功能變化,Evans Blue和TTC雙染法測定心肌梗死面積,ELISA法檢測血清中CK-MB和c Tn I含量,HE染色觀察心肌組織損傷程度;將候選藥效物質(zhì)給予SI/R損傷原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,再結(jié)合細(xì)胞存活率,以及釋放的LDH活性,綜合進行藥效評價。3.抗炎作用:將藥效物質(zhì)及DHI分別給予MI/R損傷大鼠和SI/R損傷原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,ELISA法檢測大鼠血清和細(xì)胞上清中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β和IL-10的含量,western blot法檢測NF-kB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況,評價藥效物質(zhì)和DHI的抗炎作用。4.抗氧化應(yīng)激作用:將藥效物質(zhì)及DHI分別給予MI/R損傷大鼠和SI/R損傷原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,采用生化法檢測MI/R損傷大鼠血清和SI/R損傷原代心肌細(xì)胞上清中MDA和SOD的水平,western blot法檢測氧化應(yīng)激通路轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)情況,評價藥效物質(zhì)和DHI的抗氧化應(yīng)激作用。5.抗凋亡作用:將藥效物質(zhì)及DHI分別給予SI/R損傷原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色法檢測細(xì)胞的凋亡情況,ELISA法檢測凋亡級聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)酶Caspase-3的活性,評價藥效物質(zhì)和DHI的抗凋亡作用。6.激活RISK信號通路:將藥效物質(zhì)及DHI分別給予SI/R損傷原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,同時給予PI3K抑制劑wortmannin和ERK1/2抑制劑U0126,western blot法檢測PI3K/Akt和ERK1/2信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá),證實藥效物質(zhì)和DHI對RISK通路的激活。第二部分:丹參-大黃對藥改善CKI的藥效物質(zhì)及作用機制1.藥效物質(zhì)篩選:建立體外轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)損傷HK-2細(xì)胞,將丹參和大黃中主要成分丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、原兒茶醛、迷迭香酸、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素分別給予模型細(xì)胞,MTT法檢測細(xì)胞存活率,ELISA法檢測細(xì)胞炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-1β的釋放量,再通過MTT法檢測不同配比對細(xì)胞存活率的影響,篩選丹參-大黃對藥中發(fā)揮腎保護作用的候選藥效物質(zhì)及最佳比例。2.候選藥效物質(zhì)反饋驗證:建立大鼠5/6腎切除(5/6 nephrectomy,5/6Nx)模型模擬臨床的CKI。將候選藥效物質(zhì)分別給予5/6Nx大鼠,監(jiān)測動物體重和腎功(Scr和BUN)水平,16周后觀察殘存腎臟形態(tài),超聲造影檢測腎臟血流供應(yīng)情況,電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)的變化,綜合進行藥效評價。3.抗纖維化作用:將藥效物質(zhì)分別或組合給予5/6Nx大鼠,Masson染色和HE染色觀察殘存腎組織的纖維化變性,統(tǒng)計腎小球硬化指數(shù)和腎小管損傷評分,免疫組化法檢測纖維化標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和α-SMA的表達(dá),western blot法檢測TGF-β/Smad3通路及其他纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá);將藥效物質(zhì)分別或組合給予TGF-β?lián)p傷的HK-2細(xì)胞,免疫熒光染色法檢測E-cadherin和α-SMA的表達(dá),評價藥效物質(zhì)的抗纖維化作用。4.抗炎作用:將藥效物質(zhì)分別或組合給予5/6Nx大鼠,RT-PCR法和ELISA法分別檢測殘存腎組織中TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6的m RNA水平和因子含量,western blot法檢測炎癥通路相關(guān)蛋白NF-kB、IkBα、ICAM-1和VCAM-1的表達(dá),評價藥效物質(zhì)的抗炎作用。5.抗凋亡作用:將藥效物質(zhì)分別或組合給予5/6Nx大鼠和TGF-β?lián)p傷的HK-2細(xì)胞,TUNEL染色法分別檢測殘存腎組織和細(xì)胞的凋亡情況,western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá),評價藥效物質(zhì)的抗凋亡作用。6.激活Sirt3/FOXO3a通路:將藥效物質(zhì)分別或組合給予5/6Nx大鼠,免疫組化法檢測腎組織中Sirt3和Ac-FOXO3a的表達(dá),western blot法檢測腎組織勻漿中Sirt3/FOXO3a通路相關(guān)蛋白的表達(dá),評價藥效物質(zhì)對Sirt3/FOXO3a通路的激活作用。在HK-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Sirt3 si RNA,再次考察上述纖維化、炎癥和凋亡指標(biāo)的表達(dá),驗證Sirt3在藥效物質(zhì)發(fā)揮腎保護中的關(guān)鍵作用。研究結(jié)果:第一部分:丹參-紅花對藥改善MI/R損傷的藥效物質(zhì)及作用機制1.藥效物質(zhì)篩選:通過體外MTT實驗和心肌酶檢測,篩選出了DHI中的5種具有心肌保護作用的候選藥效物質(zhì),分別為羥基紅花黃色素A(A)、丹酚酸B(B)、丹參素(C)、原兒茶醛(D)和迷迭香酸(E)。2.候選藥效物質(zhì)反饋驗證:在MI/R損傷大鼠中,DHI、A、B、C和5種單體的混合物均使大鼠各項心功能參數(shù)較MI/R組升高,心肌梗死面積減少,大鼠血清中CK-MB和c Tn I的含量降低,心肌組織病理損傷得到改善,而D和E則無明顯變化,且5種單體的混合物與DHI的藥效相當(dāng);在SI/R損傷心肌細(xì)胞中,DHI、A、B和C均使細(xì)胞存活率升高,LDH活性降低,能夠減輕SI/R損傷程度,與體內(nèi)實驗結(jié)果一致,證實了A、B、C即為DHI中的藥效物質(zhì)。3.抗炎作用:無論在MI/R損傷大鼠血清或SI/R損傷心肌細(xì)胞上清中,A、B、C和DHI均能顯著降低損傷后心肌細(xì)胞的IL-1β和TNF-α含量、升高IL-10水平,抑制炎癥通路相關(guān)因子NF-κB的表達(dá),且這種作用在應(yīng)用了PI3K的抑制劑wortmannin或ERK的抑制劑U0126后消失。組間比較結(jié)果顯示,A的抗炎作用優(yōu)于B和C,與DHI相當(dāng)。4.抗氧化應(yīng)激作用:在MI/R損傷大鼠血清或SI/R損傷心肌細(xì)胞上清中,A、B、C和DHI均能顯著降低損傷后心肌細(xì)胞的MDA含量、升高SOD水平,抑制氧化應(yīng)激通路相關(guān)因子Nrf2的表達(dá),應(yīng)用wortmannin或U0126使這種作用消失。組間比較結(jié)果顯示,B的抗氧化作用優(yōu)于A和C,與DHI相當(dāng)。5.抗凋亡作用:在SI/R損傷心肌細(xì)胞中,流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果均表明,A、B、C和DHI能顯著降低細(xì)胞凋亡率,抑制Caspase-3的活性,應(yīng)用wortmannin或U0126使這種作用消失。組間比較結(jié)果顯示,C的體外抗凋亡作用略優(yōu)于A和B,與DHI相當(dāng)。6.激活RISK信號通路:western blot結(jié)果表明,給予A、B、C和DHI預(yù)處理均能使p-Akt和p-ERK1/2表達(dá)上調(diào),與SI/R組相比具有極顯著性差異。應(yīng)用wortmannin或U0126后,這種作用被逆轉(zhuǎn),表明A、B、C和DHI通過激活RISK信號通路發(fā)揮作用。第二部分:丹參-大黃對藥改善CKI的藥效物質(zhì)及作用機制1.藥效物質(zhì)篩選:通過體外MTT實驗和炎癥因子檢測,篩選出了丹參-大黃中的2種具有腎保護作用的候選藥效物質(zhì),分別為丹參素和大黃酸;通過檢測兩種單體不同配比對細(xì)胞存活率的影響,確定1:1配比的保護作用最強,與丹參-大黃配伍相當(dāng)。2.候選藥效物質(zhì)反饋驗證:在5/6Nx模型大鼠體內(nèi)給藥16周后,丹參素和大黃酸聯(lián)用顯著改善因部分腎切除造成的大鼠生長緩慢、腎功能損傷和腎組織超微結(jié)構(gòu)改變,增加腎血流供應(yīng),具有明確的腎損傷保護作用,療效顯著優(yōu)于單味藥,證實了丹參素和大黃酸即為丹參-大黃對藥中的藥效物質(zhì)。3.抗纖維化作用:在5/6Nx大鼠體內(nèi),丹參素和大黃酸聯(lián)用顯著改善腎纖維化程度,減輕病理損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn),其機制為抑制TGF-β/Smad3通路,增加腎臟纖維化的標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá),降低α-SMA、Collagen-I和FN表達(dá),兩藥合用的抗纖維化作用優(yōu)于單味藥。4.抗炎作用:在5/6Nx大鼠體內(nèi),丹參素和大黃酸聯(lián)用顯著抑制炎癥反應(yīng),降低TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6的m RNAR水平和因子含量,其機制為抑制NF-?B通路及粘附分子相關(guān)蛋白的表達(dá),兩藥合用的抗炎作用優(yōu)于單味藥。5.抗凋亡作用:在5/6Nx大鼠體內(nèi)和TGF-β?lián)p傷的HK-2細(xì)胞中,丹參素和大黃酸聯(lián)用顯著降低TUNEL陽性染色率,抑制細(xì)胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn),還能降低損傷的細(xì)胞中Bax和Caspase-3表達(dá),增加Bcl-2表達(dá),兩藥合用的抗凋亡作用優(yōu)于單味藥。6.激活Sirt3/FOXO3a通路:在5/6Nx大鼠中,丹參素和大黃酸聯(lián)用可增加Sirt3表達(dá),降低Ac-FOXO3a/FOXO3a的比值,激活Sirt3/FOXO3a通路;在Sirt3表達(dá)干擾的HK-2細(xì)胞中,丹參素和大黃酸聯(lián)用增加E-cadherin表達(dá)、抑制α-SMA表達(dá)、阻斷TGF-β/Smad3通路、減少炎癥因子釋放和抑制細(xì)胞凋亡的作用均消失,提示Sirt3在藥物保護腎損傷中起著不可缺少的作用。研究結(jié)論:1.丹參和紅花配伍制成的DHI中的主要藥效物質(zhì)為羥基紅花黃色素A(A)、丹酚酸B(B)和丹參素(C)。2.三種藥效物質(zhì)和DHI具有明確的改善MI/R損傷的作用。3.三種藥效物質(zhì)和DHI能抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。4.三種藥效物質(zhì)和DHI通過激活RISK信號通路,保護MI/R損傷心肌。5.丹參和大黃對藥中的主要藥效物質(zhì)為丹參素和大黃酸。6.丹參素和大黃酸聯(lián)用具有明確的改善CKI的作用。7.丹參素和大黃酸聯(lián)用能抑制腎臟纖維化、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。8.丹參素和大黃酸聯(lián)用通過激活Sirt3/FOXO3a通路,改善CKI。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1-1 RISK 信號通路示意圖路家族概況徑廣泛存在于體內(nèi)各器官，功能多樣。PI3K 的下游核心瘤的 AhR 基因缺陷小鼠身上發(fā)現(xiàn)，被證實與自發(fā)性被定義為癌基因[28]。Akt 不僅是 PI3K 的直接靶點，化使 Akt 活化，進而將 PI3K 使動的信息傳遞至下游廣泛存在于真核生物中，其級聯(lián)途徑是信號傳遞網(wǎng)絡(luò)關(guān)注的 ERK 信號通路是上世紀(jì) 90 年代初發(fā)現(xiàn)的一類型（ERK1 和 ERK2），二者有 90%的同源性[30]。當(dāng)受徑被激活且磷酸化形式表達(dá)上調(diào)[27]。多種物質(zhì)（內(nèi)源

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文為 10 組：除 Control 按照常規(guī)條件培養(yǎng)外，其余細(xì)胞均進行 SI/RBS、丹參素、丹酚酸 A、丹酚酸 B、原兒茶醛、迷迭香酸、羥基花苷和 DHI。MTT 結(jié)果表明，SI/R 引起細(xì)胞死亡，與 Control 組（P<0.01）（如圖 2-1）；除丹酚酸 A 和紅花苷以外，與 SI/R 組相顯著提高細(xì)胞存活率，尤其以丹參素、丹酚酸 B、羥基紅花黃色素（P<0.01）。提示這些藥物對 H9c2 細(xì)胞具有保護作用。

2-2 候選藥效物質(zhì)對 SI/R 損傷的 H9c2 細(xì)胞的釋放 CK-MB 的影參素；SalA：丹酚酸 A；SalB：丹酚酸 B；PAl：原兒茶醛；RA：迷迭香酸；黃色素 A；CA：紅花苷；DHI：丹紅注射液。##P< 0.01 vs.Control;*P< 0.05 v/R.H釋放 LDH 情況如圖 2-3 所示。與 Control 組相比，SI/R 誘導(dǎo)細(xì)胞（P<0.01）；除丹酚酸 A 和紅花苷以外，其余藥物均能較 SI/R 組量，尤其以丹參素、丹酚酸 B、羥基紅花黃色素 A 和 DHI 最為顯著（P藥物對 H9c2 細(xì)胞具有保護作用。

本文編號：2814899