【摘要】：研究背景類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種全身性慢性自身免疫性疾病,主要表現(xiàn)為滑膜侵襲性增生,最終形成血管翳,導致關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)既是RA關(guān)節(jié)損傷的效應細胞,也參與關(guān)節(jié)破壞,其功能的改變在RA的疾病進程中起著至關(guān)重要的作用。RAFLS的形態(tài)學與生物學行為均呈現(xiàn)"類腫瘤樣"改變,處于"穩(wěn)定活化"(stable activation)的狀態(tài),除分泌大量的炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、趨化因子外,其遷移、侵襲、異常增殖和抗凋亡能力也異常增強,滑膜炎癥持續(xù)存在,最終導致血管翳形成,侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì),對疾病的預后造成不良影響。益母草堿(leonurine)是從益母草中提取的中藥單體,既往研究表明其具有雙向調(diào)節(jié)子宮平滑肌、抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫及抑制腫瘤等多種藥理學作用,但對于RA的影響,至今尚未見報道。由于益母草堿對于腫瘤、乳腺炎以及人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)的抑制作用及其涉及的調(diào)節(jié)機制與炎癥及免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān),因此我們推測:益母草堿對RA炎癥因子釋放及異常生物學行為也具有調(diào)控作用。為此,本文擬研究益母草堿對RAFLS活化及異常生物學行為的調(diào)控,并進一步探討其可能機制及作用靶點,最后通過膠原誘導型關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced Arthritis,CIA)小鼠驗證其對體內(nèi)滑膜炎癥及關(guān)節(jié)破壞的影響。一、益母草堿對類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞的活化、遷移和侵襲的影響目的:1.培養(yǎng)和鑒定RAFLS。2.研究益母草堿對RAFLS活化、增殖、凋亡、遷移和侵襲的調(diào)控作用。方法:10例符合美國風濕病學會1987年RA診斷標準的患者,通過關(guān)節(jié)鏡下滑膜切除術(shù)取得其滑膜組織,采用膠原酶消化培養(yǎng)法及組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)獲得原代FLS。采用細胞免疫熒光法對FLS中特異表達的vimentin蛋白進行鑒定。采用MTT法檢測益母草堿對RAFLS細胞活力的影響,采用RT-qPCR檢測炎癥因子、MMPs的mRNA表達,采用CBA法和ELISA法檢測炎癥因子、MMPs的蛋白表達,采用EDU法檢測細胞增殖功能,采用流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡能力,采用劃痕、體外遷移及侵襲實驗檢測細胞體外遷移和侵襲功能,采用免疫熒光法標記細胞偽足形成。結(jié)果:體外分離培養(yǎng)的原代細胞有vimentin高表達,鑒定為RA FLS。MTT實驗結(jié)果顯示:使用5μM、10μM、20μM益母草堿和5μMMTX處理RAFLS24h及48h,與空白組相比,RAFLS的細胞活力無顯著改變(P0.05)。在炎癥因子TNF-α(1Ong/ml)刺激條件下,大部分炎癥細胞因子和MMPs的表達水平顯著升高,但是經(jīng)過益母草堿和MTX干預后,RAFLS中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α與MMP-1、MMP-3的表達水平相對于TNF-α組顯著降低(P0.05或P0.01),且呈濃度依賴性,提示益母草堿和MTX可抑制RA FLS的活化。增殖凋亡實驗結(jié)果顯示:益母草堿對RAFLS的增殖和凋亡能力無影響(P0.05),而MTX可顯著降低RAFLS的增殖能力,同時促進細胞凋亡(P0.01)。在劃痕實驗中,益母草堿組、MTX組與空白組相比,劃痕明顯,細胞融合生長不明顯。在體外遷移、侵襲實驗中,益母草堿組、MTX組與空白組相比,遷移過膜的細胞明顯減少(P0.05或P0.01)。偽足形成實驗顯示:益母草堿高劑量組和MTX組偽足形成能力明顯弱于空白組(P0.05),提示益母草堿和MTX能顯著抑制RAFLS的遷移及侵襲能力。結(jié)論:益母草堿能顯著抑制RAFLSIL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α與MMP-1、MMP-3的表達及分泌,同時對RA FLS的遷移和侵襲亦有抑制作用。二、益母草堿抑制類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞活化、遷移和侵襲的分子機制研究目的:研究益母草堿調(diào)控RAFLS活化、遷移和侵襲的分子信號機制。方法:取培養(yǎng)至3-5代并經(jīng)過鑒定的RAFLS進行實驗。采用免疫印跡法檢測信號通路蛋白NF-κB、IκBα、IKK、p38、JNK、ERK及其磷酸化水平。免疫熒光法檢測NF-κB p65入核情況。RT-qPCR法檢測信號通路蛋白抑制劑對RAFLS IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α與MMP-1、MMP-3表達的影響。體外遷移或侵襲實驗檢測信號通路蛋白抑制劑對細胞體外遷移、侵襲功能的影響。結(jié)果:益母草堿可下調(diào)由TNF-α引起的NF-κB和IκBα的磷酸化水平,并抑制由TNF-α引起的NF-κB p65入核。益母草堿也可顯著下調(diào)TNF-α引起的p38 MAPK和JNKMAPK的磷酸化水平(P0.05或P0.01)。p38MAPK抑制劑SB203580可顯著抑制由TNF-α引起的NF-κB和IKBα的磷酸化(P0.05),而JNKMAPK抑制劑SP600125對NF-κB和IκBα的磷酸化無明顯影響(P0.05)。SB203580、SP600125和NF-κB抑制劑PDTC均可以顯著抑制RAFLS分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和MMP-1、MMP-3,并抑制RAFLS的遷移與侵襲能力(P0.05或P0.01)。提示益母草堿是通過p38介導的NF-κB信號通路和JNK MAPK信號通路調(diào)控RA FLS炎癥因子及MMPs的表達和體外遷移、侵襲功能。結(jié)論:益母草堿通過p38/IκBα/NF-κB信號通路和JNK MAPK調(diào)控RA FLS的活化、遷移及侵襲。三、益母草堿對小鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎的治療作用目的:觀察益母草堿對小鼠CIA關(guān)節(jié)炎模型的治療作用。方法:SPF級DBA/1雄性小鼠32只,8周齡,除正常組外,其余小鼠予牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑的乳化劑造模。將CIA小鼠隨機分為三組,分別為模型組、益母草堿組、MTX組。小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病之日起,給予腹腔注射相應溶劑和藥物,連續(xù)給藥28天。觀察小鼠的一般情況、關(guān)節(jié)炎癥狀、踝關(guān)節(jié)腫脹程度等。28天后取踝關(guān)節(jié),固定、脫鈣、脫水、包埋切片,進行HE染色并觀察其病理改變,采用ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α表 達量。結(jié)果:CIA模型小鼠第一次免疫后11-13天開始發(fā)病,踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫,加強免疫后大部分小鼠發(fā)病,嚴重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動受限,并隨時間推移而逐漸加重。益母草堿組和MTX組踝關(guān)節(jié)紅腫癥狀及關(guān)節(jié)炎評分、后肢腫脹體積較模型組明顯降低(P0.05或P0.01)。組織病理學改變:正常組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整,未見滑膜增生及炎癥細胞浸潤。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)處滑膜增生,炎癥細胞浸潤明顯,細胞排列紊亂,并出現(xiàn)軟骨和骨的侵蝕破壞。益母草堿組和MTX組滑膜病理改變較輕,滑膜少許增生,炎性細胞浸潤明顯減少,未出現(xiàn)軟骨和骨破壞。與模型組比較,益母草堿組和MTX組病理學評分下降具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。血清炎癥因子改變:造模后,模型組較正常組IL-1β、IL-6、TNF-α表達明顯上升(P0.05或P0.01)。與模型組比較,益母草堿組和MTX組IL-1β、IL-6、TNF-α表達明顯降低(P0.01)。結(jié)論:益母草堿能有效控制CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀,抑制滑膜炎癥及關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞。益母草堿對RA的滑膜炎癥以及隨后的關(guān)節(jié)破壞均有一定的治療作用。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

ＲＡＦＬＳ培外分離培養(yǎng)的ＲＡＦＬＳ貼壁生長，呈長梭形或紡錘形，聚集生長，少數(shù)有數(shù)類似于神經(jīng)元，胞核呈卵圓型位于細胞中央（圖１Ａ）。Ｖｉｍｅｎｔｉｎ是在ＦＬＳ的微絲蛋白［１３６］，采用細胞免疫熒光實驗顯示細胞表達ｖｉｍｅｎｔｉｎ邋（圖１Ｂ），分離培養(yǎng)的細胞為ＲＡ邋ＦＬＳ。逡逑

我們采用ＭＴＴ實驗分析益母草堿和ＭＴＸ對ＲＡ邋ＦＬＳ細胞活力的影響，并根據(jù)文獻逡逑研宄結(jié)果初步確定本實驗中益母草堿和ＭＴＸ的實驗濃度結(jié)果顯示，５ＭＭ、逡逑１０ｎＭ、２０（ａＭ益母草堿和５＾；ＭＭＴＸ干預ＲＡＦＬＳ２４ｈ及４８ｈ，與空白組比較，ＲＡＦＬＳ逡逑的細胞活力無顯著改變（Ｐ＞0．0５），而ｌＯＯ＾Ｍ益母草堿干預２４ｈ及５０（ｉＭ、ｌＯＯ＾Ｍ益母草逡逑堿干預１＾？１＾４８１１，可顯著抑制１＾？１＾的細胞活力（戶＜０．０５）（表２，圖２）。為去除逡逑藥物細胞毒性對后續(xù)研宄的影響，我們選擇５ｐＭ、１０ｐＭ、２０＾Ｍ益母草堿（低、中、逡逑高劑量）和５＾ＭＭＴＸ作為以下實驗的濃度。逡逑表２益母草堿對ＲＡ邋ＦＬＳ細胞活力的影響（＾±５）逡逑組別邐Ｎ邐２４小時抑制率（％）邋４８小時抑制率（％）逡逑￣＂空白組邐５邐９９．８９邋＋邋７．邋１３邐９９．８９邋＋邋８．５２逡逑益母草堿組（５x幔╁危靛危梗福矗

本文編號：2758497