發(fā)布時(shí)間：2020-07-18 05:39

【摘要】：研究背景心力衰竭(心衰)與胰島素抵抗之間存在密切的關(guān)系。一方面,胰島素抵抗是心衰發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;另一方面,心衰患者也較普遍存在胰島素抵抗,且有胰島素抵抗的心衰患者預(yù)后更差。然而,以往的這些研究主要關(guān)注的是全身胰島素抵抗(systemic insulin resistance)與心衰的關(guān)系。我們和其他課題組近年均發(fā)現(xiàn),胰島素抵抗有器官特異性。心肌也是胰島素作用的靶器官之一,但由于心肌只占到機(jī)體體重的0.5%,對(duì)整體血糖水平的影響不大,長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)心肌胰島素敏感性問(wèn)題亦未引起足夠的重視。我們課題組的前期研究提示,心肌胰島素抵抗(myocardial insulin resistance)與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著直接的關(guān)系,但心肌胰島素抵抗在心衰過(guò)程中所起的作用及其機(jī)制目前尚不清楚。研究目的1.明確心肌梗死后心肌胰島素敏感性是否發(fā)生變化,心肌缺血后是否會(huì)發(fā)生心肌胰島素抵抗?2.若存在心肌胰島素抵抗,探討其發(fā)生的主要機(jī)制及其與缺血后心衰發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)方法大鼠冠脈左前降支結(jié)扎造缺血性心衰模型。在心梗手術(shù)前和心梗1 wk、2 wk、4wk和8 wk后,對(duì)大鼠行超聲心動(dòng)圖檢測(cè),檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)和收縮功能。測(cè)定空腹血糖和血清胰島素水平,行葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠全身胰島素敏感性。應(yīng)用小動(dòng)物PET/CT測(cè)定胰島素刺激下心肌對(duì)氟脫氧葡萄糖(FDG)的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUVmax,standardized uptake value)評(píng)價(jià)心肌胰島素敏感性,Western blot方法分析在不同情況下心肌胰島素信號(hào)分子的變化。以酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)測(cè)定心肌與血清TNF-α的水平。應(yīng)用過(guò)表達(dá)TNF-α的腺病毒間接經(jīng)冠脈轉(zhuǎn)染正常大鼠心肌,以表達(dá)GFP的腺病毒作為對(duì)照,觀察TNF-α在心肌過(guò)表達(dá)能否直接引起心肌胰島素抵抗。另一方面,在心肌缺血前兩天開(kāi)始給予大鼠腹腔注射TNF-α拮抗劑依那西普(Etanercept)300μg/250 g體重,然后在缺血1 wk內(nèi)每?jī)商旄骨蛔⑸湎嗤瑒┝恳滥俏髌?觀察拮抗TNF-α對(duì)心肌胰島素敏感性的影響。參照前期相關(guān)研究,在缺血1 wk內(nèi)給予大鼠胰島素治療,觀察其對(duì)心肌胰島素敏感性和心衰進(jìn)程的影響。委托南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所構(gòu)建胰島素受體(Insr)基因基于Cre-Lox P條件性敲除小鼠Insrfl/fl,與肌球蛋白重鏈α(α-MHC)調(diào)控的他莫昔芬誘導(dǎo)Cre表達(dá)的小鼠(α-MHC-Mer Cre Mer)雜交后得到α-MHC-Mer Cre Mer/Insrfl/fl小鼠。選用8-10周齡的α-MHC-Mer Cre Mer/Insrfl/fl雄性小鼠給予腹腔注射他莫昔芬50 mg/kg,連續(xù)3天,以誘導(dǎo)心肌特異性Cre的表達(dá),敲除心肌胰島素受體基因,得到他莫昔芬誘導(dǎo)的心肌特異性胰島素受體敲除小鼠(tamoxifen-induced cardiomyocyte-specific insulin receptor knockout,TCIRKO)。行葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的全身胰島素敏感性。缺血前和缺血4 wk后,對(duì)心肌特異性胰島素受體敲除小鼠和對(duì)照小鼠用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)和功能變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.心肌缺血后心功能進(jìn)行性降低,室腔逐漸擴(kuò)大。手術(shù)前,假手術(shù)(Sham)組和心肌缺血(MI)組的EF、LVESD和LVEDD值無(wú)明顯差異。心肌缺血1 wk時(shí),MI組的射血分?jǐn)?shù)(EF)從手術(shù)前的71.6±1.9%下降到53.1±3.4%(P0.001),左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)從0.22±0.03 cm增加到0.45±0.03 cm(P0.001),左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)從0.51±0.02 cm增加到0.65±0.03 cm(P0.001)。在心肌缺血4 wk時(shí),MI組的EF下降到40.1±3.1%,LVESD增加到0.62±0.03cm,LVEDD增加到0.75±0.03 cm,其中EF和LVESD與心肌缺血1 wk時(shí)相比均有明顯差異(P0.05和P0.01)。在心肌缺血8 wk時(shí),MI組的EF值為38.2±4.3%,LVESD與LVEDD分別為0.63±0.03 cm、0.78±0.03 cm,與心肌缺血4 wk時(shí)相比無(wú)明顯差異。2.心肌缺血1 wk時(shí),心肌發(fā)生胰島素抵抗,而全身胰島素敏感性無(wú)明顯變化。與基礎(chǔ)狀態(tài)(未予胰島素刺激)相比,胰島素可明顯增加Sham組大鼠心肌FDG攝取(SUVmax 5.1±0.5 vs.0.9±0.2 g/ml,n=6,P0.001)。與Sham組大鼠相比,心肌缺血30 min時(shí)胰島素刺激下的心肌FDG攝取值更高(SUVmax 9.5±0.8 vs.5.1±0.5 g/ml,n=6,P0.001),但在此之后(缺血1 d到2 wk)胰島素刺激下的心肌FDG攝取逐漸降低。與Sham組相比,心肌缺血1 wk與2 wk時(shí)胰島素刺激下的心肌FDG攝取均明顯降低(SUVmax MI 1 wk 2.7±0.4 vs.5.1±0.5 g/ml;MI 2 wk 2.1±0.5 vs.5.1±0.5 g/ml,n=6,均P0.01),而在心肌缺血1 d、1 wk和2 wk時(shí),空腹血糖(FPG)、血清胰島素水平(FIN)、定量胰島素敏感性檢測(cè)指數(shù)(Quantitative insulin sensitivity check index,QUICKI)與Sham組相比均無(wú)明顯差異,口服葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)的結(jié)果也無(wú)明顯差異,表明心衰早期有心肌胰島素抵抗的發(fā)生,但并無(wú)全身胰島素敏感性的明顯變化。3.心肌缺血1 wk時(shí),心肌的胰島素信號(hào)通路出現(xiàn)選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。與基礎(chǔ)狀態(tài)相比,胰島素刺激可明顯增加Sham組心肌Akt的磷酸化和GLUT4的膜轉(zhuǎn)位,輕度增加ERK 1/2的磷酸化,而對(duì)p38 MAPK的磷酸化無(wú)明顯影響。在心肌缺血1d時(shí),胰島素刺激仍可增加心肌Akt和ERK 1/2的磷酸化,增加GLUT4的膜轉(zhuǎn)位,減少p38 MAPK的磷酸化。但在心肌缺血1 wk時(shí),與基礎(chǔ)狀態(tài)相比,胰島素刺激增加心肌Akt磷酸化和GLUT4膜轉(zhuǎn)位的效應(yīng)明顯降低,而明顯增加心肌p38 MAPK的磷酸化。上述結(jié)果表明,正常情況下胰島素可激活A(yù)kt和ERK 1/2,但在心肌缺血1 wk時(shí),胰島素激活A(yù)kt和ERK 1/2受阻,而明顯激活p38 MAPK,即出現(xiàn)胰島素信號(hào)通路的選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。4.正常心肌過(guò)表達(dá)TNF-α直接引起心肌胰島素抵抗。與轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)GFP腺病毒的對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)TNF-α腺病毒的大鼠心肌中TNF-α的水平明顯升高,但血清中的TNF-α未能測(cè)出(低于ELISA試劑盒的測(cè)定下限10 pg/ml)。在GFP腺病毒轉(zhuǎn)染心肌1 wk時(shí),胰島素刺激可明顯增加心肌FDG攝取,Akt磷酸化和GLUT4轉(zhuǎn)位。然而,在TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染心肌1 wk時(shí),胰島素的上述效應(yīng)明顯被抑制,與此同時(shí),TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染心肌的p38 MPAK的磷酸化明顯增加。5.心肌過(guò)表達(dá)TNF-α加重缺血后的心臟功能障礙和心室擴(kuò)張。GFP腺病毒和TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染前大鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)與室腔內(nèi)徑無(wú)明顯差異。行腺病毒轉(zhuǎn)染的同時(shí),結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支造心肌缺血模型。在心肌缺血1 wk時(shí),與GFP腺病毒轉(zhuǎn)染心肌相比,TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染的心臟射血分?jǐn)?shù)更低(EF 41.3±4.2 vs.55.2±3.4%,n=6,P0.05),室腔內(nèi)徑更大(LVESD 0.63±0.04 vs.0.52±0.03 cm,n=6,P0.05)。在缺血4 wk時(shí),GFP腺病毒和TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)與室腔內(nèi)徑無(wú)明顯差異。6.給予依那西普降低心肌TNF-α水平,可部分恢復(fù)心肌的胰島素敏感性,但未能改善缺血后心臟的功能和心室重構(gòu)。大鼠心肌缺血1 d和1 wk后心肌TNF-α水平明顯升高,而血清TNF-α水平未能測(cè)出,依那西普干預(yù)后心肌TNF-α水平明顯降低。在心肌缺血1 wk時(shí),胰島素刺激下FDG攝取、Akt磷酸化和GLUT4轉(zhuǎn)位均明顯降低,而給予依那西普可部分恢復(fù)了胰島素的上述效應(yīng),下調(diào)p38MAPK的磷酸化水平。大鼠缺血4 wk時(shí),生理鹽水處理組大鼠與依那西普處理組大鼠心臟的射血分?jǐn)?shù)與左室收縮末期內(nèi)徑均無(wú)明顯差異(EF 43.0±2.7%vs.40.1±3.1%,LVESD 0.60±0.03 cm vs.0.62±0.03 cm,n=6,P0.1)。7.缺血早期胰島素干預(yù)可改善缺血后心肌胰島素敏感性和心臟功能,抑制左室擴(kuò)張。缺血后早期胰島素干預(yù)(心肌缺血30 min后從尾靜脈泵注50 U/L胰島素2.5h,泵注速率4 ml/kg/h,然后在缺血1 wk內(nèi)每天給大鼠皮下注射胰島素0.5 U/kg BW)可明顯降低缺血1 d和1 wk后非梗死區(qū)心肌的TNF-α含量,改善心肌缺血1 wk時(shí)胰島素刺激的FDG攝取。與生理鹽水對(duì)照組相比,早期胰島素干預(yù)組的心臟功能(EF,54.3±4.1%vs.40.1±3.1%,n=6,P0.05)明顯增加,左室收縮末期內(nèi)徑明顯降低(圖6F,LVESD,0.48±0.04 cm vs.0.62±0.03 cm,n=6,P0.05)。8.心肌特異性胰島素受體敲除加重小鼠缺血后心臟功能障礙和室腔擴(kuò)張。Western blot的結(jié)果顯示,TCIRKO小鼠表現(xiàn)為心肌特異性的胰島素受體敲除(骨骼肌和肝臟的胰島素受體表達(dá)正常)。基礎(chǔ)狀態(tài)下,TCIRKO小鼠與對(duì)照小鼠心臟的心臟功能和室腔內(nèi)徑相比無(wú)明顯差異,但在心肌缺血4 wk后,與對(duì)照小鼠相比,TCIRKO小鼠的射血分?jǐn)?shù)更低(EF 31.5±2.4%vs.45.2±2.7%,n=6,P0.05),左室收縮末期容積更大(LVESV 56.0±5.3μl vs.35.4±3.5μl,n=6,P0.05)。結(jié)論1.缺血性心衰早期(1 wk)即出現(xiàn)心肌胰島素抵抗,且獨(dú)立于全身胰島素抵抗而存在;2.心肌梗死所致心肌局部TNF-α大量產(chǎn)生是缺血后心肌胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制之一;3.缺血早期給予胰島素對(duì)缺血心臟具有保護(hù)作用,可延緩心衰的發(fā)生,而胰島素信號(hào)障礙可加速缺血性心衰的發(fā)生發(fā)展。上述結(jié)果提示心肌胰島素信號(hào)在缺血心臟保護(hù)及延緩心衰發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.6
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文合成與分泌：血管緊張素Ⅱ可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)球狀進(jìn)而促進(jìn)腎臟對(duì) Na+和水的重吸收和對(duì) K+的分泌排管收縮：血管緊張素Ⅱ可同時(shí)促使微動(dòng)脈和靜脈收靜脈收縮可使回心血量增加；③血管緊張素Ⅱ與交其釋放遞質(zhì)增加：④血管緊張素Ⅱ作用于中樞神經(jīng)緊張性[30]。

圖 2 對(duì)抗炎癥因子 TNF-α 的治療策略可可堿是一種可抑制 TNF-α 轉(zhuǎn)錄和翻譯的藥物。多項(xiàng)臨床研究顯示，不同心功能的心衰患者應(yīng)用后，均能改善心衰患者的左室射血分功能分級(jí)，在某些研究中，己酮可可堿對(duì)心臟的治療效果伴有循環(huán)血 T低[62]。然而，需要指出的是，己酮可可堿是一種非特異的磷酸二酯酶可可堿對(duì)心衰的有益效應(yīng)是綜合性的作用，并非完全取決于其對(duì) TNF[63]。白水平主要有兩種類型的拮抗方法，一種是應(yīng)用可溶性 TNF 受體作為止 TNF-α 與靶細(xì)胞上的同源受體結(jié)合發(fā)揮作用，代表性的藥物是依那西NF p75 受體和一個(gè) lgG 的 FC 段組成。早期的臨床前研究表明，依那西F-α 引起的負(fù)性肌力效應(yīng)。基于此開(kāi)展的Ⅰ期臨床研究顯示，納入的中患者在服用依那西普 3 個(gè)月后，6 分鐘步行距離增加，左室射血分?jǐn)?shù)提后開(kāi)展了兩項(xiàng)多中心臨床研究，一項(xiàng)是北美的名為 RENAISSA

圖 3 胰島素信號(hào)通路示意圖[82]IRS是連接胰島素受體和下游信號(hào)分子的紐帶，近來(lái)研究顯示，IRS的酪氨酸磷酸化可促進(jìn)胰島素信號(hào)通路的下傳，而絲氨酸磷酸化對(duì)胰島素信號(hào)通路起到阻礙的作用，很多引起胰島素抵抗的因素比如炎癥因子即是作用于IRS位點(diǎn)，引起IRS的絲氨酸磷酸化增加，導(dǎo)致胰島素信號(hào)通路下傳受阻。IRS激活后，可進(jìn)而活化PI3-激酶（PI3K），PI3K可催化磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸（PIP2）為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3 可與磷脂酰肌醇依賴激酶（PDK1）結(jié)合激活A(yù)kt上述的胰島素抵抗主要是指全身的胰島素抵抗，表現(xiàn)為血糖或血清胰島素水平。Akt為絲氨酸/蘇氨酸激酶，其Ser473 位點(diǎn)和Thr308 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化后激活介導(dǎo)胰島素在胞內(nèi)的重要生物學(xué)效應(yīng)，包括增加糖攝取，促進(jìn)糖原合成和蛋白質(zhì)合成等，而胰島素抵抗的一個(gè)重要分子機(jī)制是Akt的Ser473 和Thr308 位點(diǎn)磷酸化受阻[83]。2.3 心肌胰島素抵抗及其發(fā)生機(jī)制

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2760494