【摘要】：背景肌腱病是一組由于過度使用導(dǎo)致的肌肉骨骼疾病的總稱,發(fā)病率約為2%~65%,占所有運動相關(guān)疾病的30%~50%,逐漸成為影響人類運動能力和生活質(zhì)量的主要疾病之一。目前,關(guān)于肌腱病的治療方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),治療效果不甚滿意,復(fù)發(fā)率高,根本原因在于肌腱病的發(fā)病機制尚未確切,導(dǎo)致治療上缺乏針對性。隨著研究工作的深入,神經(jīng)性炎癥在肌腱病發(fā)病機制中的作用日益受到關(guān)注。P物質(zhì)(Substance P,SP)是一種重要的促炎癥反應(yīng)的介質(zhì),參與痛覺傳遞和加劇神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn),肌腱病組織中SP及其受體NK-1R表達(dá)升高,肌腱病變及臨床癥狀與SP陽性的神經(jīng)纖維增多相關(guān),并且SP能促進(jìn)肌腱組織增生、膠原重塑、肌腱細(xì)胞增殖并加速肌腱的無菌性反應(yīng);同時,SP還是具有機械反應(yīng)性的炎癥介質(zhì),肌腱細(xì)胞在體外機械牽伸的條件下分泌SP;SP還可影響干細(xì)胞的分化,如促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。肌腱干細(xì)胞(TSCs)作為肌腱細(xì)胞的唯一前體細(xì)胞,具有較強的增殖和分化能力,TSCs的分化命運是決定肌腱微損傷修復(fù)成功與否的關(guān)鍵因素之一。TSCs的分化受各種機械和生化因素的影響。適度機械牽伸(4%)可誘導(dǎo)TSCs正常分化為肌腱細(xì)胞,促進(jìn)損傷的自我修復(fù);過度機械牽伸(8%)可誘導(dǎo)TSCs異常分化為成脂肪、成軟骨和成骨細(xì)胞,促進(jìn)肌腱病形成。已有研究發(fā)現(xiàn)機械牽伸可刺激TSCs分泌炎癥介質(zhì),而且某些炎癥介質(zhì)也可影響TSCs的增殖和分化,為闡明肌腱病的發(fā)病機制提供了新的思路。回顧文獻(xiàn),有關(guān)SP對TSCs增殖和多向分化的作用還未見報道。目的本研究的主要目的包括觀察臨床肌腱病標(biāo)本的SP表達(dá)情況與病理學(xué)特征;利用離體細(xì)胞模型明確過度牽伸對TSCs分泌SP的作用、SP對TSCs增殖和分化的影響;利用在體動物模型觀察外源性SP在肌腱病形成中的作用。材料與方法1.肌腱病SP表達(dá)與病理學(xué)特征觀察2013年5月至2014年4月在我院行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的患者,分為兩組。腱病組:關(guān)節(jié)鏡證實為肩袖腱病的的患者,取岡上肌腱標(biāo)本,共15例;對照組:行關(guān)節(jié)鏡下肩關(guān)節(jié)穩(wěn)定手術(shù)的患者,取肩胛下肌腱標(biāo)本,共8例。用免疫熒光染色檢測臨床標(biāo)本的SP表達(dá),并進(jìn)行半定量的統(tǒng)計學(xué)分析;人肩袖腱病組織的組織學(xué)評估,包括H-E染色、Masson染色觀察以及組織病理學(xué)評分。2.過度機械牽伸對TSCs分化和SP表達(dá)的影響TSCs的分離培養(yǎng)與鑒定。觀察TSCs的細(xì)胞形態(tài)和克隆形成能力;免疫熒光檢測干細(xì)胞標(biāo)志物(Nanog,Nucleostemin和Oct-4)和SP及其受體NK-1R的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原進(jìn)行檢測,包括CD31、CD34、CD44和CD90;為驗證TSCs的多向分化能力,分別對TSCs進(jìn)行成骨、成脂肪和成軟骨誘導(dǎo)分化。利用我們課題組前期自行設(shè)計制作的新型體外細(xì)胞機械牽伸模型,對TSCs進(jìn)行機械牽伸(8%,1HZ);用RT-PCR檢測其SP及其受體NK-1R的基因表達(dá)情況;用Western-Blot和ELISA法檢測SP及其受體NK-1R的蛋白表達(dá)水平。加入NK-1R拮抗劑(5×10-6M)后,對TSCs進(jìn)行機械牽伸;用RT-PCR檢測TSCs的多向分化基因表達(dá)情況。3.SP對TSCs增殖、凋亡和異常分化的影響CCK-8檢測不同濃度SP對TSCs增殖的影響;(對照組、10-6M的SP組、10-7M的SP組、10-8M的SP組、10-9M的SP組和10-10M的SP組)CCK-8檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs增殖的影響;結(jié)晶紫染色檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs活力的影響;細(xì)胞爬片Ki67免疫熒光檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs增殖的影響;流式細(xì)胞學(xué)檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs凋亡的影響。(對照組、5×10-6M的NK-1R拮抗劑+10-6M的SP組、10-6M的SP組)RT-PCR和免疫熒光檢測(10-6M)SP對TSCs的干性的影響;多向誘導(dǎo)分化檢測(10-6M)SP對TSCs的分化的影響;RT-PCR檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs分化相關(guān)基因的表達(dá)的影響;免疫熒光檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs分化相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。(對照組、5×10-6M的NK-1R拮抗劑+10-6M的SP組、10-6M的SP組)4.外源性SP對大鼠肌腱病形成的作用將36只SD大鼠隨機分為三組,即對照組(生理鹽水)、低劑量SP組(0.5×10-6M)和高劑量SP組(5×10-6M)。每組12只。分別于14天和28天各處死18只大鼠(每組6只),取跟腱標(biāo)本。大鼠肌腱標(biāo)本的組織學(xué)檢測,包括H-E染色、Masson染色觀察以及組織學(xué)評分;免疫熒光檢測肌腱成脂肪、成軟骨和成骨相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1.免疫熒光檢測結(jié)果顯示,肌腱病組和對照組的SP和NK-1R均有表達(dá),肌腱病組的SP陽性面積百分比顯著大于對照組(P㩳0.05)。組織學(xué)評分結(jié)果顯示,肌腱病組的組織學(xué)評分顯著高于對照組(P㩳0.05)。肌腱病組的膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞,排列紊亂、卷曲,組織增生,細(xì)胞明顯增多,細(xì)胞核變性、碎裂,新生血管形成,甚至可見脂肪樣變和玻璃樣變等。2.過度機械牽伸導(dǎo)致TSCs的SP基因和蛋白水平表達(dá)顯著升高(P0.05)。過度機械牽伸導(dǎo)致TSCs的非肌腱細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)明顯增高,如Runx2(成骨細(xì)胞標(biāo)志),PPARγ(成脂肪細(xì)胞標(biāo)志),Sox9和Collagen type II(成軟骨細(xì)胞標(biāo)志)(P0.05),加入NK-1R拮抗劑組的PPARγ,Sox9和Collagen type II的表達(dá)較牽伸組顯著降低(P0.05)。3.CCK-8結(jié)果顯示SP促進(jìn)了TSCs增殖,并且劑量和時間依賴性的;結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示SP增加了TSCs的細(xì)胞活力;流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示SP抑制了TSCs的凋亡。SP對TSCs增殖和凋亡的作用可有效地被NK-1R拮抗劑所抑制。SP降低了TSCs的干性。RT-PCR結(jié)果顯示,SP組的干細(xì)胞相關(guān)基因Nanog和Nuclestemin的表達(dá)均顯著低于對照組(P0.05);免疫熒光檢測結(jié)果顯示,SP組的Nanog和Nuclestemin染色的陽性細(xì)胞數(shù)均顯著低于對照組(P0.05)。SP促進(jìn)TSCs成脂肪和成軟骨分化。RT-PCR結(jié)果顯示,SP組的成脂肪(PPARγ)和成軟骨(ColⅡ,Sox9)基因表達(dá)均顯著高于對照組(P0.05),成骨(Runx2)基因表達(dá)差異不顯著(P0.05),而成肌腱的標(biāo)志基因(TNC,Tnmd)則顯著減低(P0.05);SP+NK-1R拮抗劑組的成脂肪(PPARγ)和成軟骨(ColⅡ,Sox9)基因表達(dá)顯著的低于SP組(P0.05);而SP+NK-1R拮抗劑組與對照組的相關(guān)基因表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。免疫熒光染色檢測結(jié)果進(jìn)一步證實了上述結(jié)果。4.組織學(xué)評分結(jié)果顯示,高劑量SP組的總評分顯著高于低劑量SP組和對照組(P㩳0.05),而低劑量SP組與對照組差異不顯著(P0.05);免疫熒光結(jié)果顯示,高劑量SP組的PPARγ和ColⅡ表達(dá)均顯著高于低劑量SP組和對照組(P㩳0.05);低劑量SP組的PPARγ、ColⅡ和Runx2的表達(dá)較對照組差異不顯著(P0.05)。結(jié)論1.證實了肌腱病組和正常組都可表達(dá)SP,但肌腱病組織中SP表達(dá)更強烈;驗證了肩袖腱病的病理學(xué)特征符合肌腱病的普遍組織病理學(xué)表現(xiàn),如膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂、組織增生、細(xì)胞增多、新生血管形成、脂肪樣變和玻璃樣變等。2.過度機械牽伸可刺激TSCs分泌SP;過度機械牽伸可促進(jìn)TSCs異常分化;NK-1R拮抗劑可有效抑制過度牽伸導(dǎo)致的TSCs成脂肪和成軟骨分化。3.SP通過其受體NK-1R刺激TSCs增殖和抑制TSCs凋亡,可能通過促進(jìn)肌腱組織增生和細(xì)胞增多而加快肌腱病的形成;SP通過其受體NK-1R促進(jìn)TSCs成脂肪和成軟骨分化,可能通過促進(jìn)脂肪變性和軟骨化對肌腱病的形成起促進(jìn)作用。4.外源性SP促進(jìn)大鼠肌腱組織增生、細(xì)胞增多、新生血管形成和膠原紊亂并導(dǎo)致脂肪化和軟骨化等肌腱病形成的作用呈劑量依賴性,即低劑量SP促肌腱病形成的作用不明顯,而高劑量SP促進(jìn)肌腱病形成。SP促進(jìn)TSCs增殖和異常分化可能是在肌腱病形成中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R686.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡大海,陳璧,朱雄翔,陶克,湯朝武,王劍波;P物質(zhì)上調(diào)正常人真皮成纖維細(xì)胞TGF-β_1的mRNA表達(dá)[J];中華整形外科雜志;2002年04期

2 馬林;唐康來;周兵華;楊廣華;陳萬;穆米多;袁成松;;機械牽伸對體外大鼠肌腱干細(xì)胞RhoA/Rho相關(guān)蛋白激酶分子表達(dá)的影響[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2014年05期

本文編號：2751928