【摘要】：大血管病變,如冠心病,中風(fēng)是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的最主要原因。糖尿病大血管病變的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂,主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,纖維帽變薄,壞死脂質(zhì)核心破裂,脫落,形成不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。目前針對糖尿病大血管病變的療效并不能令人滿意,如：降脂和抗血小板的藥物不能穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊,而球囊擴(kuò)張可能導(dǎo)致再狹窄。因此,探索糖尿病大血管病變的發(fā)病機(jī)制,并尋找新的穩(wěn)定糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的方法,是治療糖尿病心腦血管疾病等糖尿病大血管病變的重要手段。內(nèi)皮細(xì)胞在維持動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性上發(fā)揮著重要的作用。高糖、高血脂和高血壓可引起內(nèi)皮功能障礙進(jìn)而破壞內(nèi)皮細(xì)胞的完整性。主要表現(xiàn)為血管壁內(nèi)皮損傷,通透性增高,膽固醇和氧化低密度脂蛋白浸潤到血管內(nèi)膜下,并大量堆積形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。隨著動(dòng)脈粥樣斑塊的發(fā)展,內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,纖維帽變薄,大的壞死脂質(zhì)核心脫落形成血栓。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是一類骨髓來源的內(nèi)皮前體細(xì)胞,當(dāng)內(nèi)皮功能發(fā)生障礙時(shí),內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠從骨髓動(dòng)員到損傷部位,分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而修復(fù)損傷的內(nèi)皮。但是,正常情況下,內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮損傷部位動(dòng)員非常有限。因此,提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員可能是一種新的方法來穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。趨化因子受體5(CCR5)作為p趨化因子受體家族成員之一,是一類G蛋白7次偶聯(lián)跨膜受體。CCR5主要表達(dá)在T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中,敲除CCR5基因的表達(dá)能夠減少單核/巨噬細(xì)胞向動(dòng)脈粥樣斑塊的集聚。CCR5的同源配體趨化因子配體5(CCL5),作為CC-趨化因子家族的成員,主要由活化的T細(xì)胞和血小板儲(chǔ)存和釋放。在動(dòng)脈粥樣硬化的過程中,CCL5表達(dá)升高主要經(jīng)由活化的血小板釋放。增加的CCL5附著在受損內(nèi)皮細(xì)胞的表面,通過與它們的受體CCR5結(jié)合進(jìn)而介導(dǎo)單核／巨噬細(xì)胞向血管損傷的部位集聚。迄今為止,CCR5在斑塊穩(wěn)定性中作用尚不清楚。最新研究顯示CCR5能夠刺激骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員,促進(jìn)腎小球微血管新生,抑制CCR5的表達(dá)能夠降低內(nèi)皮祖細(xì)胞向皮膚損傷部位的聚集。因此,我們推測增加內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5的表達(dá),能夠增加內(nèi)皮祖細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位的歸巢和動(dòng)員,進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定。第一部分趨化因子CCR5促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位遷移的研究目的探討趨化因子CCR5在內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮損傷部位遷移的趨化作用。方法1動(dòng)物模型10-12周齡的2型糖尿病ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于實(shí)驗(yàn)。選取8-10周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠用于內(nèi)皮祖細(xì)胞提取。2脾切除手術(shù)8-10周齡的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠給予0.8%戊巴比妥鈉(10 mg/kg)麻醉,沿小鼠左側(cè)腹部行10-15mm切口,脾臟周圍的動(dòng)靜脈被結(jié)扎后移除脾臟,小鼠術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)7-14天,再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3小鼠2型糖尿病模型的建立將脾切除的ApoE-/-C57BL/6J小鼠,按小鼠每公斤體重給予35mg鏈脲佐菌素(STZ,35mg/kg),腹腔注射STZ溶液,間隔24h后再次腹腔注射給藥,連續(xù)注射3天。對照組,ApoE-/-C57BL/6J小鼠腹腔給予等量的檸檬酸鈉緩沖液。造模后每天檢測小鼠體重變化,每周測量小鼠血糖,當(dāng)血糖值在300 mg/dl及其以上者,作為2型糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)。4小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定選取8-10周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠頸椎脫臼處死,無菌條件下,分離提取小鼠脛骨,股骨和髂骨中的單個(gè)核細(xì)胞,梯度離心后接種在纖維連結(jié)蛋白包被的六孔板中,放置于37℃,5% CO2孵箱中培養(yǎng),三天后細(xì)胞第一次給予完全換液,棄掉未貼壁的細(xì)胞。第六天時(shí),細(xì)胞給予半量換液,繼續(xù)培養(yǎng)至第七天即用于鑒定。細(xì)胞分別給予Dil-acLDL, BS-1 lectin和DAPI染色后,熒光顯微鏡觀察陽性染色細(xì)胞,三色熒光陽性染色的細(xì)胞即為內(nèi)皮祖細(xì)胞。5慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞將過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的慢病毒載體按MOI=40轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中,攜帶有空白質(zhì)粒的慢病毒載體轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中作為陰性對照,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后給予完全換液,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。在內(nèi)皮祖細(xì)胞移植之前,培養(yǎng)的細(xì)胞給予CM-DiI (4 mg/ml)活細(xì)胞染料孵育15分鐘,雙重標(biāo)記的EPCs被收集,用于下一步試驗(yàn)。6試驗(yàn)設(shè)計(jì)40只脾切除的2型糖尿病ApoE-/- C57BL/6J雄性小鼠給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)24周,然后根據(jù)小鼠耳標(biāo)號(hào),應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表,將老鼠隨機(jī)分為三組：Control組：尾靜脈給予200μl無菌的PBS, Lenti-EGFP組：尾靜脈給予200μl1×106攜帶有空載質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞,Lenti-CCR5組：尾靜脈給予200μl×106攜帶有過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞輸注后,所有老鼠改為普通飲食,繼續(xù)喂養(yǎng)6周后處死。7免疫熒光檢測CD31免疫熒光染色檢測小鼠主動(dòng)脈根處內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分布。8內(nèi)皮祖細(xì)胞功能學(xué)檢測Transwell遷移小室和Edu增殖能力實(shí)驗(yàn)分別檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和增殖能力。9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)、Oneway ANOVA或LSD post-hoc分析。當(dāng)P0.05被認(rèn)為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1成功構(gòu)建重組過表達(dá)慢病毒載體經(jīng)重組慢病毒載體測序?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證,CCR5慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建和包裝成功,空白載體的慢病毒滴度為3×1010 ifu/ml, CC過表達(dá)載體的慢病毒滴度為2.8×1010ifu/ml。2成功分離提取和鑒定EPCsEPCs培養(yǎng)至第7天,細(xì)胞分別給予DiI-acLDL(紅色),BS-1 lectin(綠色)和DAPI (藍(lán)色)染色后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)90%以上細(xì)胞均能成功攝取DiI-acLDL和BS-1 lectin,表現(xiàn)為三色熒光(紅色+綠色+藍(lán)色)陽性。3慢病毒轉(zhuǎn)染EPGs后感染效率免疫熒光評價(jià)EPCs轉(zhuǎn)染慢病毒后的感染效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%及以上的細(xì)胞為綠色熒光蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞,提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功。4過表達(dá)CCR5增加EPCs向內(nèi)皮損傷部位的歸巢,動(dòng)員取小鼠主動(dòng)脈根的冰凍切片,給予DAPI染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在2型糖尿病小鼠主動(dòng)脈根的內(nèi)皮和內(nèi)皮下層能明顯觀察到EPCs,提示EPCs能成功植入到血管壁內(nèi)皮層。此外,過表達(dá)CCR5內(nèi)皮祖細(xì)胞(Lenti-CCR5)組,內(nèi)皮祖細(xì)胞在內(nèi)皮損傷部位聚集的數(shù)量明顯高于單純內(nèi)皮祖細(xì)胞(Lenti-EPCs)組,提示CCR5過表達(dá)后能增加EPCs向內(nèi)皮損傷部位遷移的能力。5過表達(dá)CCR5增加EPGs遷移能力為了檢測CCR5對EPCs功能學(xué)影響,我們分別檢測了Lenti-EGFP和Lenti-CCR5兩組細(xì)胞的增殖和遷移能力的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在趨化因子CCL5存在的情況下,Lenti-CCR5組能明顯增加EPCs遷移能力(P0.01),但是兩組細(xì)胞的增殖能力并未見明顯差異(P=0.98)。結(jié)論1.過表達(dá)CCR5能夠增加內(nèi)皮祖細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位的歸巢、動(dòng)員作用；2.過表達(dá)CCR5能提高內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力,但是對其增殖能力沒有影響。小鼠主動(dòng)脈根的內(nèi)皮和內(nèi)皮下層能明顯觀察到EPCs,提示EPCs能成功植入到血管壁內(nèi)皮層。此外,過表達(dá)CCR5內(nèi)皮祖細(xì)胞(Lenti-CCR5)組,內(nèi)皮祖細(xì)胞在內(nèi)皮損傷部位聚集的數(shù)量明顯高于單純內(nèi)皮祖細(xì)胞(Lenti-EPCs)組,提示CCR5過表達(dá)后能增加EPCs向內(nèi)皮損傷部位遷移的能力。5過表達(dá)CCR5增加EPGs遷移能力為了檢測CCR5對EPCs功能學(xué)影響,我們分別檢測了Lenti-EGFP和Lenti-CCR5兩組細(xì)胞的增殖和遷移能力的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在趨化因子CCL5存在的情況下,Lenti-CCR5組能明顯增加EPCs遷移能力(P0.01),但是兩組細(xì)胞的增殖能力并未見明顯差異(P=0.98)。結(jié)論1.過表達(dá)CCR5能夠增加內(nèi)皮祖細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位的歸巢、動(dòng)員作用；2.過表達(dá)CCR5能提高內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力,但是對其增殖能力沒有影響。第二部分過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性目的探討過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5對動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性研究。方法1動(dòng)物模型10-12周齡的ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于實(shí)驗(yàn)。選取8-10周齡的野生型C57BL/6J雄性小鼠用于內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取。2脾切除手術(shù)8-10周齡的ApoE-/- C57BL/6J雄性小鼠給予0.8%戊巴比妥鈉(10 mg/kg)麻醉,沿小鼠左側(cè)腹部行10-15mm切口,脾臟周圍的動(dòng)靜脈被結(jié)扎后移除脾臟,小鼠術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)7-14天,再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3小鼠骨髓來源的EPCs分離、培養(yǎng)及鑒定選取8-10周齡的野生型C57BL/6J雄性小鼠頸椎脫臼處死,無菌條件下,分離提取小鼠脛骨,股骨和髂骨中的單個(gè)核細(xì)胞,梯度離心后接種在纖維連結(jié)蛋白包被的六孔板中,放置于37℃,5% CO2孵箱中培養(yǎng),三天后細(xì)胞第一次給予完全換液,棄掉未貼壁的細(xì)胞。第六天時(shí),細(xì)胞給予半量換液,繼續(xù)培養(yǎng)至第七天即用于鑒定。細(xì)胞分別給予DiI-acLDL, BS-1 lectin和DAPI染色后,熒光顯微鏡觀察陽性染色細(xì)胞,三色熒光(紅色+綠色+藍(lán)色)陽性染色的細(xì)胞即為內(nèi)皮祖細(xì)胞。4慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞將過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的慢病毒載體按MOI=40轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中,攜帶有空白質(zhì)粒的慢病毒載體轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中作為陰性對照,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后給予完全換液,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。在內(nèi)皮祖細(xì)胞移植之前,培養(yǎng)的細(xì)胞給予CM-DiI (4 mg/ml)活細(xì)胞染料孵育15分鐘,雙重標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞被收集,用于下一步試驗(yàn)。5試驗(yàn)設(shè)計(jì)60只脾切除的ApoE-/- C57BL/6J雄性小鼠給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)24周,然后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表,將老鼠隨機(jī)分為三組：Control組：尾靜脈給予200μl無菌的PBS, Lenti-EGFP組：尾靜脈給予200μl 1×106攜帶有空載質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞,Lenti-CCR5組：尾靜脈給予200μl 1×106攜帶有過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞輸注后,所有老鼠改為普通飲食,繼續(xù)喂養(yǎng)6周后處死。6組織病理、免疫組化及免疫熒光檢測油紅O染色實(shí)驗(yàn)評價(jià)小鼠主動(dòng)脈根處動(dòng)脈粥樣斑塊面積,免疫組織化學(xué)染色方法分別檢測人和小鼠冠狀動(dòng)脈處CCL5和CCR5的表達(dá)、小鼠主動(dòng)脈根處平滑肌α肌動(dòng)蛋白、單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞,、炎癥因子IL-6、MMP9等表達(dá)。免疫熒光染色方法檢測小鼠主動(dòng)脈根處內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。7免疫化學(xué)檢測小鼠給予內(nèi)皮祖細(xì)胞移植后分別于0周和6周采集全血,高速離心后,收集血清。應(yīng)用小鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的蛋白芯片檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的22個(gè)炎癥指標(biāo)變化,Cluster version 3.0和Java Tree View version 1.60軟件用于分析蛋白芯片的結(jié)果。倍數(shù)變化(FC)被用來確定對照組與治療組之間炎癥指標(biāo)變化程度。NO代謝物試劑盒檢測血清中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量變化。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測小鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、炎癥因子IL-6的表達(dá)變化。8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)、Oneway ANOVA或LSD post-hoc分析。當(dāng)P0.05被認(rèn)為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1 CCL5和CCR5在人和ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)和分布情況免疫組織化學(xué)染色方法檢測趨化因子CCL5在不同時(shí)期人類動(dòng)脈粥樣斑塊中的分布和表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCL5分別能夠在無斑塊(內(nèi)膜,9.93±4.57%；中膜,0.43±0.29%；外膜：17.91±2.66%),有穩(wěn)定斑塊(內(nèi)膜,22.18±3.37%；中膜,23.87±5.04%,外膜：28.31±4.42%)和不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊(內(nèi)膜,23.38±3.23%；中膜,22.42±9.02%；外膜：43.37±0.67%)的冠狀動(dòng)脈中檢測到。實(shí)時(shí)定量分析進(jìn)一步顯示：與無斑塊的冠狀動(dòng)脈相比,有穩(wěn)定斑塊的冠狀動(dòng)脈中CCL5在血管內(nèi)膜和中膜區(qū)域的表達(dá)明顯增加(內(nèi)膜,P0.05；中膜,P0.01),但是CCL5表達(dá)含量在不穩(wěn)定斑塊與穩(wěn)定的斑塊的血管內(nèi)膜和中膜之間,并沒有顯著性差異(內(nèi)膜,P=0.64；中膜,P=0.81)。此外,與無斑塊或有穩(wěn)定斑塊的冠狀動(dòng)脈相比,不穩(wěn)定斑塊中CCL5在血管外膜區(qū)域的表達(dá)含量明顯增加(P0.05,P0.01)。其次,我們檢測了趨化因子CCL5在ApoE-/-小鼠不同時(shí)期動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCL5能夠在無斑塊(內(nèi)膜,20.23±2.35%；中膜,19.86±4.75%；外膜：3.15±0.30%),有穩(wěn)定斑塊(內(nèi)膜,33.09±3.91%；中膜,14.41±4.21%；外膜：3.33±0.30%),不穩(wěn)定斑塊(內(nèi)膜,17.43±2.22%；中膜,36.73±0.45%；外膜：13.5±1.41%)的小鼠冠狀動(dòng)脈中被探及。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與無斑塊動(dòng)脈相比,有穩(wěn)定斑塊的冠狀動(dòng)脈,CCL5在血管內(nèi)膜區(qū)域的表達(dá)含量明顯降低(P0.01)。與無斑塊或有穩(wěn)定斑塊的冠狀動(dòng)脈相比,CCL5在不穩(wěn)定斑塊的血管中膜和外膜區(qū)域的表達(dá)含量明顯增加(中膜,P0.05,P0.01；外膜,P0.01,P0.01)。此外,我們檢測了CCR5蛋白分別在人和小鼠冠狀動(dòng)脈組織中的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCR5能夠明顯在無斑塊的動(dòng)脈處探及,并且隨著斑塊面積的增加,其表達(dá)含量明顯增加。2過表達(dá)CCR5增加EPCs向內(nèi)皮損傷部位的歸巢,動(dòng)員取ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根的冰凍切片,給予CD31免疫熒光染色,結(jié)果顯示：在ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根的內(nèi)皮和內(nèi)皮下層能明顯觀察到內(nèi)皮祖細(xì)胞,提示內(nèi)皮祖細(xì)胞能成功植入到血管壁內(nèi)皮層。此外,過表達(dá)CCR5內(nèi)皮祖細(xì)胞(Lenti-CCR5)組,內(nèi)皮祖細(xì)胞在內(nèi)皮損傷部位聚集的數(shù)量明顯高于單純內(nèi)皮祖細(xì)胞(Lenti-EPCs)組,(13.0±1.4vs.2.3±0.5,P0.01),提示CCR5過表達(dá)后能增加內(nèi)皮祖細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位遷移能力。3過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5對動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性影響油紅O染色結(jié)果分析：與Control組(19.75±2.98%)或Lenti-EGFP組(18.72±2.52%)相比,Lenti-CCR5治療組(9.58±1.51%)其斑塊面積明顯減少。免疫組化染色分析顯示：與Control組(11.4±1.78%,P0.01)或Lenti-EGFP組(7.76±2.37%,P0.05)相比,Lenti-CCR5組(2.56±0.94%)巨噬細(xì)胞陽性染色面積明顯減少。但是平滑肌α肌動(dòng)蛋白陽性染色面積在Control、Lenti-EGFP (P=0.97)、Lenti-CCR5 (P=0.76)三組之間未見顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異�？傊�,內(nèi)皮祖細(xì)胞上過表達(dá)CCR5能夠減少斑塊部位脂質(zhì)沉積和巨噬細(xì)胞的侵潤,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的穩(wěn)定。4過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5降低高脂血癥水平我們采用比色法檢測了三組小鼠血清中血脂水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與基線水平相比,Lenti-CCR5組血清中膽固醇和低密度脂蛋白水平明顯降低(膽固醇數(shù)值：25.90±4.66 vs 12.14±2.50,P0.05；低密度脂蛋白數(shù)值：4.11±0.85vs1.57±0.40,P0.01)。血清中甘油三酯和高密度脂蛋白未見明顯變化(甘油三酯水平：1.48±1.13 vs 0.68±0.15,P0.05；高密度脂蛋白水平：4.18±0.38 vs3.66±1.10,P0.05)。 Lenti-EGFP組血清中膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯和高密度脂蛋白治療前后均未見明顯性差異(P0.05,P0.05,P0.05)。5過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5對內(nèi)皮功能的影響免疫組化評價(jià)三組小鼠主動(dòng)脈根處內(nèi)皮細(xì)胞的染色強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Control組相比,Lenti-EGFP組內(nèi)皮區(qū)域CD31染色呈無或低染色強(qiáng)度,而Lenti-CCR5組CD31染色呈中到高染色強(qiáng)度。此外,NO硝酸還原酶法結(jié)果顯示,在EPCs治療0天時(shí),Control, Lenti-EGFP, Lenti-CCR5三組之間NO的含量沒有顯著性差異。6周治療后,與Lenti-EGFP組相比,Lenti-CCR5組血清中NO含量明顯增加(42.3±1.8 vs.36.6±2.8,P0.05)。6過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5降低炎癥因子表達(dá)選取小鼠動(dòng)脈粥樣硬化抗體芯片,評價(jià)跟動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的22個(gè)炎癥因子的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：6周治療后,與Control組相比,Lenti-CCR5組中有9個(gè)炎癥因子變化呈倍比程度降低,分別是IL-6、IL-5、IL-3、IL-13、CD40和TNF-α,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-6降低程度最高(FC=2)。我們采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和免疫組化分別比較三組小鼠血液循環(huán)和動(dòng)脈粥樣斑塊區(qū)域IL-6的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與基線水平相比,循環(huán)血中IL-6水平在Lenti-CCR5組表達(dá)明顯降低(P0.05)。免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Control或Lenti-EGFP組相比,IL-6陽性染色面積在Lenti-CCR5組顯著性降低(Lenti-CCR5 vs Lenti-EGFP,13.07 ± 2.11% vs 24.3 ± 4.85%, P0.05, Lenti-CCR5 vs Control,13.07 ± 2.11% vs 34.03 ±6.15%, P0.01).此外,我們評價(jià)了斑塊部位MMP9的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Control或Lenti-EGFP組相比,Lenti-CCR5組中膜區(qū)域MMP9陽性染色面積明顯降低(Lenti-CCR5 vs Lenti-EGFP,16.26±2.14% vs 23.57±0.45%, P0.01; Lenti-CCR5 vs control,16.26±2.14% vs 30.34±2.57%, P0.01)。7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)、Oneway ANOVA或LSD post-hoc分析。當(dāng)P0.05被認(rèn)為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.趨化因子CCL5和CCR5在人和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)增加；2.過表達(dá)CCR5增加內(nèi)皮祖細(xì)胞在動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位的聚集數(shù)量；3.過表達(dá)CCR5增加動(dòng)脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性,減少動(dòng)脈粥樣斑塊面積；4.過表達(dá)CCR5降低高脂血癥小鼠血清中脂質(zhì)水平；5.過表達(dá)CCR5改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙；6.過表達(dá)CCR5降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠全身和斑塊局部的炎癥反應(yīng)；
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：2730579