【摘要】：失眠癥是以入睡和(或)睡眠維持困難所致的睡眠質(zhì)量或數(shù)量達不到正常生理需求而影響社會功能的一種主觀體驗,是最常見的睡眠障礙性疾患,并且患病率很高。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查,在世界范圍內(nèi)約1/3的人有睡眠障礙,而在中國患有各類睡眠障礙的人的比例明顯高于世界27%的水平。因此,失眠的有效防治仍為全球關(guān)注的熱點。在臨床治療上,現(xiàn)代醫(yī)學主要采用鎮(zhèn)、催眠藥物,而藥物治療給患者帶來許多副作用,遠期療效較差,長期的服用還會造成成癮性、耐受性等,并非一種理想的治療方法。蒙古醫(yī)學治療失眠具有獨特的理論和良好的療效,蒙醫(yī)認為"三根失衡,赫依偏盛而位于心和白脈,其功能紊亂致赫依血相搏"是本病的基本病因病機,緊張、憂慮、恐懼、抑郁、焦慮等負面情緒及社會環(huán)境、飲食、起居、運動情況等均是外因,鎮(zhèn)赫依、調(diào)節(jié)"三根"平衡為主要治療原則。蒙醫(yī)溫針療法是用特制的銀針在人體的固定部位或其它部位給予針刺加溫灸刺激,以達到預(yù)防和治療疾病目的的一種蒙醫(yī)傳統(tǒng)療法。蒙醫(yī)溫針是集針刺效應(yīng)、溫熱效應(yīng)以及穴位特異性刺激為一體,通過對血液循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫功能等多系統(tǒng)、多渠道、多途徑的復(fù)雜機制,達到調(diào)節(jié)機體、治療疾病的目的。蒙醫(yī)溫針療法是蒙醫(yī)治療失眠的常用方法之一,具有溫通經(jīng)脈、調(diào)和氣血、調(diào)理體素、增強抵抗力以及防治疾病的作用。蒙醫(yī)文獻記載與現(xiàn)代臨床實驗證明,蒙醫(yī)溫針療法對失眠癥的療效顯著,同時具有無毒副作用安全可靠、簡便易行等優(yōu)點。因其高效、安全、無副作用、簡單易行、不產(chǎn)生藥物依賴等特點而廣泛被患者所接受。本課題首次通過蒙醫(yī)溫針刺激失眠大鼠來考察miRNAs的變化水平,從整體上而非單一指標來衡量失眠導(dǎo)致動物整體基因水平的變化情況,是一種全新的科學思維,符合蒙醫(yī)整體觀的理論。尋找相應(yīng)的靶基因,從基因?qū)用婵疾鞙蒯樦委熐昂笙嚓P(guān)細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)及與其受體特異性結(jié)合的變化規(guī)律,以及對PCPA失眠大鼠行為的影響,符合傳統(tǒng)醫(yī)學的現(xiàn)代思維,也是一種全新的嘗試,并且能夠為蒙醫(yī)基礎(chǔ)研究確定出特異性的治療失眠相關(guān)分子靶點提供參考和依據(jù)。研究目的本課題以蒙醫(yī)溫針對PCPA致失眠大鼠模型的催眠作用為切入點,考察失眠大鼠行為學相關(guān)指標,從基因水平對溫針治療前后相關(guān)miRNAs及靶基因進行探討,同時對失眠相關(guān)細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)含量觀察,探討蒙醫(yī)溫針治療失眠癥的生物學基礎(chǔ),初步闡明蒙醫(yī)溫針療法的多層面復(fù)雜機制。研究方法1.選擇腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠大鼠模型,將90只SD健康雄性大鼠,分為空白組Ⅰ、空白組Ⅱ、模型組、溫針組、模型+溫針組及模型+西藥組,每組15只,造模完成后進行行為學檢測,即一般情況觀察、自主活動度、睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間測定。2.觀察miR-101a在蒙醫(yī)溫針治療失眠大鼠前后腦組織中的表達差異,并結(jié)合生物信息學技術(shù),構(gòu)建miR-101a及PAX8載體,采用熒光定量PCR、熒光素酶報告基因、蛋白印跡檢測等不同方法驗證miR-101a對PAX8基因的靶向調(diào)控關(guān)系,從不同層面上觀測溫針治療前后PAX8的變化規(guī)律。3.采用酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜加電化學(HPLC-ECD)等檢測各組大鼠腦組織的細胞因子IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)的水平。結(jié)果1.睡眠時間:蒙醫(yī)溫針組與空白組比較睡眠時間延長,有明顯差異(P0.01);蒙醫(yī)溫針對大鼠入睡率無作用,與空白組比較無顯著差異(P0.05);對睡眠潛伏期無明顯作用,與空白組比較無顯著差異(P0.05)。2.自主活動度:自由活動上,各組大鼠失眠第七天,模型組在活動時間上明顯高于空白組(P0.01);模型組的停留時間高于空白組,但無明顯差異(P0.05)。站立次數(shù)上,模型組站立次數(shù)明顯高于對照組,有明顯差異(P0.05);蒙醫(yī)溫針組明顯低于模型組(P0.05)。3.相對于正常大鼠,蒙醫(yī)溫針治療后,有141個miRNAs表達存在差異;變化最為顯著的為miR-101a,相比模型組升高了 98倍。我們接下來對15只溫針治療失眠大鼠的miR-101a的水平進行了熒光實時定量PCR研究,發(fā)現(xiàn)中位數(shù)由模型組的的-2.9倍上升到了 3.2倍(P0.01)。通過熒光實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),相對于正常大鼠的腦組織細胞,失眠模型組大鼠腦組織miR-101a的表達水平明顯下調(diào)(p0.05);經(jīng)過溫針治療后,miR-101a的表達水平明顯上升,恢復(fù)到接近正常值(p0.05)。空白神經(jīng)細胞中,相對于陰性對照組,轉(zhuǎn)染miR-101 a mimics的細胞中72小時后miR-101a的表達量明顯升高(p0.05),轉(zhuǎn)染miR-101ainhibitor顯著降低(p0.05);在失眠模型組中,相對于陰性對照組,轉(zhuǎn)染miR-101a mimics的細胞中72小時后miR-101a的表達量明顯升高(p0.05),轉(zhuǎn)染miR-101a inhibitor無顯著變化;蒙醫(yī)溫針治療后,相對于陰性對照組,轉(zhuǎn)染miR-101a mimics的細胞中72小時后miR-101a的表達量明顯升高(p0.05),轉(zhuǎn)染miR-101ainhibitor顯著降低(p0.05)。4.蛋白印跡結(jié)果顯示:體外培養(yǎng)失眠模型大鼠神經(jīng)元細胞,對比加入scramble組加入miR-101amimics72小時后,PAX8蛋白的表達出現(xiàn)抑制,呈顯著的下調(diào)(P0.01);熒光素酶報告結(jié)果顯示:相對于空白質(zhì)粒組pGL3M,陰性對照組pGL3M-MUT-PAX8-3' UTR及pGL3M-WT-PAX8-3' UTR均沒有顯著性變化,加入miR-101a mimics后,MUT組的活性沒有出現(xiàn)顯著性的變化,而WT組熒光強度顯著下降,說明miR-101a能夠與WT-PAX8-3' UTR啟動子中特異順序結(jié)合,而改變了啟動子的特異序列,則miR-101a不起作用。5.失眠大鼠下丘腦、海馬和大腦前額葉皮質(zhì)組織中白細胞介素IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α水平與空白對照組相比明顯降低(P0.05)。經(jīng)過治療后,無論是溫針治療還是西藥治療,各部位白細胞介素IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α水平與模型組相比均顯著提升(P0.05)。對大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測結(jié)果顯示,失眠模型組大鼠NE、DA、Glu水平明顯高于空白對照組(P0.05),而經(jīng)過溫針或西藥治療,NE、DA、Glu水平則與失眠模型組相比較有了明顯降低,差異顯著(P0.05),溫針治療效果和西藥治療效果差異不明顯,說明兩者治療效果相近。失眠模型組大鼠5-HT、GABA、Ach水平明顯低于空白對照組差異顯著(P0.05),與失眠模型組比較,溫針或西藥治療后失眠大鼠5-HT、GABA、Ach水平明顯升高,差異顯著(P0.05)。結(jié)論1.蒙醫(yī)溫針療法可顯著改善失眠大鼠的行為狀態(tài)及睡眠持續(xù)時間。2.蒙醫(yī)溫針療法可直接上調(diào)失眠大鼠體內(nèi)miR-101a水平,并且驗證了蒙醫(yī)溫針改善失眠與miR-101a調(diào)節(jié)PAX8基因有直接關(guān)聯(lián)。3.蒙醫(yī)溫針可對失眠大鼠腦組織中IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α及(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)異常起到調(diào)節(jié)作用。4.蒙醫(yī)溫針通過上調(diào)miR-101a及PAX8基因,對多種神經(jīng)遞質(zhì)起到了調(diào)節(jié)作用。5.蒙醫(yī)溫針療法通過"鎮(zhèn)赫依"、"改善氣血"、提高免疫力等作用,具有良好的改善失眠的功能。同時具有操作簡便、安全有效、毒副作用小等優(yōu)勢及特點。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R29

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本文編號：2626652