【摘要】：牙種植術是目前修復牙齒缺失或牙列缺損的重要方法之一,種植體與牙周組織直接接觸,缺少牙周膜樣的結(jié)構作為緩沖,增加了種植體所受的力矩,使得種植體與骨之間結(jié)合欠佳或由于結(jié)合時間過久而導致種植手術的失敗。目前已有許多文獻報道了以干細胞為基礎的組織工程再生技術能夠有效恢復受損的牙周組織。牙周膜干細胞和頜骨間充質(zhì)干細胞作為牙周再生的種子細胞,具有多向分化和自我更新的潛能,是牙周組織再生的關鍵。純鈦表面的納米管形貌能夠模擬自然的骨組織結(jié)構,因此從仿生學的角度來看納米管結(jié)構具有較好的生物學活性。Ti O2納米管形貌已經(jīng)普遍用于多種細胞的研究中,包括成骨細胞、纖維細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞、肌肉細胞、表皮角化細胞和間充質(zhì)干細胞等。而納米管形貌對人來源的牙周膜干細胞和頜骨間充質(zhì)干細胞的影響如何,目前還未見文獻報道,因此本課題研究了鈦表面納米管形貌對這兩種干細胞生物學行為的影響,為優(yōu)化種植體的表面結(jié)構、促進種植體與牙周組織的結(jié)合,提供更加全面的理論指導。實驗一Ti O2納米管微觀形貌的制備【目的】在鈦表面構建不同管徑的納米管形貌,為后續(xù)實驗提供研究模型�！痉椒ā坑貌煌侄鹊纳凹垖⑩伇砻鎾伖庵羚R面,放置在含0.5%氫氟酸的電解液內(nèi),在三種電壓下(5V、10V、20V)分別陽極氧化處理1 h,試樣表面超聲清洗后,采用場發(fā)射掃描電鏡觀察鈦表面的納米管形貌�！窘Y(jié)果】鈦表面經(jīng)陽極氧化處理后形成排列整齊的均勻納米管結(jié)構,納米管直徑大小與陽極氧化電壓成正相關,在5V、10V、20V電壓下分別形成25、50和90 nm的納米管結(jié)構�！窘Y(jié)論】陽極氧化能夠在鈦表面形成不同管徑的均勻Ti O2納米管形貌。實驗二Ti O2納米管對牙周膜干細胞成牙周組織的影響【目的】評價Ti O2納米管形貌對牙周膜干細胞(PDLSCs)的形態(tài)變化、粘附行為、增殖能力及成牙周組織能力的影響�！痉椒ā坎捎糜邢尴♂尫ǚ蛛xPDLSCs,將其接種于不同管徑的納米管表面,采用掃描電鏡觀察不同試樣表面細胞的形態(tài);用Hoechst染細胞核觀察細胞的粘附;CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖水平;ALP試劑盒檢測細胞的活性;天狼星紅染色觀察不同試樣表面膠原的分泌;茜素紅染色觀察不同試樣表面的胞外基質(zhì)礦化;流式細胞儀檢測細胞周期;實時定量PCR檢測細胞在納米管表面的基因水平。【結(jié)果】和Ti對照組相比,PDLSCs在不同管徑的納米管表面呈紡錘形生長,有許多的絲狀和板狀偽足,同時可以觀察到納米管形貌促進了PDLSCs的早期粘附;細胞周期檢測結(jié)果顯示,NT10和NT20輕微促進了PDLSCs的有絲分裂,而CCK-8的結(jié)果顯示,納米管形貌抑制了PDLSCs的增殖,這可能由于在細胞的增殖和分化中發(fā)生了拮抗反應,也可能是由于不同實驗處理細胞的方法不同而產(chǎn)生的;納米管形貌促進了PDLSCs的膠原分泌和Col-I、Col-III的基因表達;在未成骨誘導的條件下,納米管形貌不能促進PDLSCs向成骨方向分化;在基因檢測中,NT5促進了periostin和S100A4的表達上調(diào)�！窘Y(jié)論】不同管徑的納米管形貌能誘導細胞形成不同的細胞骨架形態(tài),納米管形貌促進了PDLSCs的早期粘附和膠原分泌,并促進了相關基因的表達。實驗三Ti O2納米管對頜骨間充質(zhì)干細胞生物學行為的影響【目的】評價Ti O2納米管形貌對頜骨間充質(zhì)干細胞(BMSCs)形態(tài)變化、粘附行為、增殖能力及成骨分化能力的影響�！痉椒ā繉MSCs純化后,接種于不同管徑的納米管表面,采用掃描電鏡觀察不同試樣表面細胞的形態(tài);用Hoechst染細胞核觀察細胞的粘附;CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖水平;ALP試劑盒檢測細胞的活性;天狼星紅染色觀察不同試樣表面的膠原分泌;茜素紅染色觀察不同試樣表面胞外基質(zhì)礦化;實時定量PCR檢測細胞在納米管表面的基因水平�！窘Y(jié)果】和Ti對照組相比,BMSCs在不同管徑的納米管表面伸展較快,有許多絲狀和板狀偽足伸出,同時可以觀察到納米管形貌促進了BMSCs早期的粘附,其中NT5和NT10的細胞粘附數(shù)量有顯著性的差異;細胞增殖實驗結(jié)果顯示,NT5和NT10促進了BMSCs在其表面的增殖水平,結(jié)果顯示BMSCs在小管徑表面增殖的能力較為明顯,隨著納米管直徑的增加,細胞的增殖能力逐漸減弱;在成骨和未成骨誘導的條件下,NT20都促進了BMSCs在納米管表面ALP的活性和膠原的分泌,且納米管形貌也促進了Col-I和Col-III的基因表達;在未成骨誘導的條件下,納米管形貌沒有明顯促進BMSCs向成骨方向分化;在成骨相關的基因表達中,NT20促進了ALP和RUNX2的表達上調(diào)�！窘Y(jié)論】納米管形貌促進了BMSCs的早期粘附,小管徑的納米管形貌促進了細胞增殖,大管徑的納米管形貌促進了細胞的ALP活性、膠原分泌和成骨基因的表達。實驗四復合細胞膜片在Ti O2納米管周圍再生牙周組織的體內(nèi)研究【目的】構建PDLSCs和BMSCs復合膜片,及其在Ti O2納米管周圍再生牙周組織的體內(nèi)研究�！痉椒ā坎捎糜邢尴♂尫ǐ@得人的PDLSCs和BMSCs;運用流式細胞術對兩種干細胞的表面分子進行檢測;克隆形成實驗觀察細胞的克隆能力;CCK-8試劑盒測定細胞的生長曲線;通過茜素紅和油紅染色觀察干細胞向成骨和成脂方向分化的潛能;維生素C誘導兩種干細胞形成細胞膜片;細胞膜片包裹Ti復合羥基磷灰石(HA)在體外培養(yǎng)1個月后檢測牙周相關的基因表達;兩種細胞膜片包裹不同管徑的Ti O2納米管放置于HA孔內(nèi),將其復合體植入裸鼠背部,8周后取材,進行硬組織切片和VG染色,評價復合體在裸鼠體內(nèi)異位牙周再生的能力�！窘Y(jié)果】通過有限稀釋法分離獲得了人的PDLSCs和BMSCs,兩種細胞具有良好的克隆形成能力和增殖能力,通過流式細胞儀檢測其表面分子,證明兩種細胞均為間充質(zhì)干細胞;通過茜素紅和油紅染色,證明兩種干細胞具有向成骨和成脂方向分化的潛能;細胞膜片包裹Ti復合HA的基因檢測結(jié)果顯示Col-I、Col-III和S100A4的表達上調(diào),雖然不是所有的納米管形貌都促進了表達的上調(diào),但依然可以表明納米管形貌能夠促進細胞膜片向牙周膜方向的分化;裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明,納米管形貌能夠促進復合膜片向牙周方向再生,其中在復合膜片/NT10/HA復合體表面有類似牙骨質(zhì)樣的結(jié)構形成,而沒有支架材料HA包裹的細胞膜片,在裸鼠體內(nèi)不能形成連續(xù)的形態(tài)結(jié)構,并且復合細胞膜片較單一來源的細胞膜片再生能力更強�！窘Y(jié)論】有限稀釋法分離培養(yǎng)的人PDLSCs和BMSCs具有多向分化和自我更新的潛能;納米管形貌能夠促進復合膜片在裸鼠體內(nèi)的牙周異位再生。本課題創(chuàng)新點:1.首次將人來源的牙周膜干細胞和頜骨間充質(zhì)干細胞應用在納米管形貌上進行研究,明確了不同管徑的納米管形貌對兩種干細胞生物學行為的影響。2.構建了不同來源的復合細胞膜片在納米管周圍牙周再生的模型,并對多種來源和單一來源的細胞膜片的包裹方式相比較,明確了不同來源的復合膜片的組織再生能力更強。3.通過裸鼠的體內(nèi)實驗明確了納米管形貌能夠促進牙周組織的再生,并且確定出NT10的納米管形貌更接近天然的骨組織形態(tài),為牙周再生提供了理論指導,并顯示出一定的應用前景。
【圖文】：

只彡哪芰�。�?1 犬牙周缺損的模型示意圖及復合物植入圖1.2 骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs 是一種來源于骨髓基質(zhì)的間充質(zhì)干細胞，既有造血的能力，又有成骨分化的能力，在一定的條件下可以分化為多種間充質(zhì)細胞，包括成纖維細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、肌肉細胞和成骨細胞等[16]，是臨床中應用較多的全能干細胞。Kramer 等[17]將人的 PDLSCs 和 BMSCs 兩種干細胞共培養(yǎng) 7 天后，發(fā)現(xiàn) BMSCs中的骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達增高而骨涎蛋白的表達降低，可能是由于牙周膜干細胞誘導了間充質(zhì)干細胞向牙周膜方向分化，，利用這一特點可以更好的將 BMSCs 應用于牙周修復及再生的研究中。Kim 等[18]將成年比格犬的 PDLSCs 和 BMSCs 聯(lián)合 HA/TCP 的復合物，植入牙槽窩內(nèi)，進行熒光標記 8 周后取材，結(jié)果顯示在牙槽骨處有大量的新骨形成，靠近HA/TCP 處的熒光強度較深，BMSCs 可以促進骨缺損周圍新骨形成。Yang 等[19]將熒光鼠的細胞體外培養(yǎng)后

GFP+蛋白標記新形成的牙骨質(zhì)區(qū)域
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R783.6


本文編號：2586422