【摘要】：牙種植術(shù)是目前修復(fù)牙齒缺失或牙列缺損的重要方法之一,種植體與牙周組織直接接觸,缺少牙周膜樣的結(jié)構(gòu)作為緩沖,增加了種植體所受的力矩,使得種植體與骨之間結(jié)合欠佳或由于結(jié)合時(shí)間過(guò)久而導(dǎo)致種植手術(shù)的失敗。目前已有許多文獻(xiàn)報(bào)道了以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程再生技術(shù)能夠有效恢復(fù)受損的牙周組織。牙周膜干細(xì)胞和頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞作為牙周再生的種子細(xì)胞,具有多向分化和自我更新的潛能,是牙周組織再生的關(guān)鍵。純鈦表面的納米管形貌能夠模擬自然的骨組織結(jié)構(gòu),因此從仿生學(xué)的角度來(lái)看納米管結(jié)構(gòu)具有較好的生物學(xué)活性。Ti O2納米管形貌已經(jīng)普遍用于多種細(xì)胞的研究中,包括成骨細(xì)胞、纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、表皮角化細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等。而納米管形貌對(duì)人來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞和頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞的影響如何,目前還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,因此本課題研究了鈦表面納米管形貌對(duì)這兩種干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為優(yōu)化種植體的表面結(jié)構(gòu)、促進(jìn)種植體與牙周組織的結(jié)合,提供更加全面的理論指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)一Ti O2納米管微觀形貌的制備【目的】在鈦表面構(gòu)建不同管徑的納米管形貌,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供研究模型�！痉椒ā坑貌煌侄鹊纳凹垖⑩伇砻鎾伖庵羚R面,放置在含0.5%氫氟酸的電解液內(nèi),在三種電壓下(5V、10V、20V)分別陽(yáng)極氧化處理1 h,試樣表面超聲清洗后,采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察鈦表面的納米管形貌�！窘Y(jié)果】鈦表面經(jīng)陽(yáng)極氧化處理后形成排列整齊的均勻納米管結(jié)構(gòu),納米管直徑大小與陽(yáng)極氧化電壓成正相關(guān),在5V、10V、20V電壓下分別形成25、50和90 nm的納米管結(jié)構(gòu)�！窘Y(jié)論】陽(yáng)極氧化能夠在鈦表面形成不同管徑的均勻Ti O2納米管形貌。實(shí)驗(yàn)二Ti O2納米管對(duì)牙周膜干細(xì)胞成牙周組織的影響【目的】評(píng)價(jià)Ti O2納米管形貌對(duì)牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)的形態(tài)變化、粘附行為、增殖能力及成牙周組織能力的影響�！痉椒ā坎捎糜邢尴♂尫ǚ蛛xPDLSCs,將其接種于不同管徑的納米管表面,采用掃描電鏡觀察不同試樣表面細(xì)胞的形態(tài);用Hoechst染細(xì)胞核觀察細(xì)胞的粘附;CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖水平;ALP試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的活性;天狼星紅染色觀察不同試樣表面膠原的分泌;茜素紅染色觀察不同試樣表面的胞外基質(zhì)礦化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞在納米管表面的基因水平�！窘Y(jié)果】和Ti對(duì)照組相比,PDLSCs在不同管徑的納米管表面呈紡錘形生長(zhǎng),有許多的絲狀和板狀偽足,同時(shí)可以觀察到納米管形貌促進(jìn)了PDLSCs的早期粘附;細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,NT10和NT20輕微促進(jìn)了PDLSCs的有絲分裂,而CCK-8的結(jié)果顯示,納米管形貌抑制了PDLSCs的增殖,這可能由于在細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)生了拮抗反應(yīng),也可能是由于不同實(shí)驗(yàn)處理細(xì)胞的方法不同而產(chǎn)生的;納米管形貌促進(jìn)了PDLSCs的膠原分泌和Col-I、Col-III的基因表達(dá);在未成骨誘導(dǎo)的條件下,納米管形貌不能促進(jìn)PDLSCs向成骨方向分化;在基因檢測(cè)中,NT5促進(jìn)了periostin和S100A4的表達(dá)上調(diào)�！窘Y(jié)論】不同管徑的納米管形貌能誘導(dǎo)細(xì)胞形成不同的細(xì)胞骨架形態(tài),納米管形貌促進(jìn)了PDLSCs的早期粘附和膠原分泌,并促進(jìn)了相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)三Ti O2納米管對(duì)頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響【目的】評(píng)價(jià)Ti O2納米管形貌對(duì)頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)形態(tài)變化、粘附行為、增殖能力及成骨分化能力的影響�！痉椒ā繉MSCs純化后,接種于不同管徑的納米管表面,采用掃描電鏡觀察不同試樣表面細(xì)胞的形態(tài);用Hoechst染細(xì)胞核觀察細(xì)胞的粘附;CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖水平;ALP試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的活性;天狼星紅染色觀察不同試樣表面的膠原分泌;茜素紅染色觀察不同試樣表面胞外基質(zhì)礦化;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞在納米管表面的基因水平�！窘Y(jié)果】和Ti對(duì)照組相比,BMSCs在不同管徑的納米管表面伸展較快,有許多絲狀和板狀偽足伸出,同時(shí)可以觀察到納米管形貌促進(jìn)了BMSCs早期的粘附,其中NT5和NT10的細(xì)胞粘附數(shù)量有顯著性的差異;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NT5和NT10促進(jìn)了BMSCs在其表面的增殖水平,結(jié)果顯示BMSCs在小管徑表面增殖的能力較為明顯,隨著納米管直徑的增加,細(xì)胞的增殖能力逐漸減弱;在成骨和未成骨誘導(dǎo)的條件下,NT20都促進(jìn)了BMSCs在納米管表面ALP的活性和膠原的分泌,且納米管形貌也促進(jìn)了Col-I和Col-III的基因表達(dá);在未成骨誘導(dǎo)的條件下,納米管形貌沒(méi)有明顯促進(jìn)BMSCs向成骨方向分化;在成骨相關(guān)的基因表達(dá)中,NT20促進(jìn)了ALP和RUNX2的表達(dá)上調(diào)�！窘Y(jié)論】納米管形貌促進(jìn)了BMSCs的早期粘附,小管徑的納米管形貌促進(jìn)了細(xì)胞增殖,大管徑的納米管形貌促進(jìn)了細(xì)胞的ALP活性、膠原分泌和成骨基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)四復(fù)合細(xì)胞膜片在Ti O2納米管周?chē)偕乐芙M織的體內(nèi)研究【目的】構(gòu)建PDLSCs和BMSCs復(fù)合膜片,及其在Ti O2納米管周?chē)偕乐芙M織的體內(nèi)研究�！痉椒ā坎捎糜邢尴♂尫ǐ@得人的PDLSCs和BMSCs;運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)兩種干細(xì)胞的表面分子進(jìn)行檢測(cè);克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的克隆能力;CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;通過(guò)茜素紅和油紅染色觀察干細(xì)胞向成骨和成脂方向分化的潛能;維生素C誘導(dǎo)兩種干細(xì)胞形成細(xì)胞膜片;細(xì)胞膜片包裹Ti復(fù)合羥基磷灰石(HA)在體外培養(yǎng)1個(gè)月后檢測(cè)牙周相關(guān)的基因表達(dá);兩種細(xì)胞膜片包裹不同管徑的Ti O2納米管放置于HA孔內(nèi),將其復(fù)合體植入裸鼠背部,8周后取材,進(jìn)行硬組織切片和VG染色,評(píng)價(jià)復(fù)合體在裸鼠體內(nèi)異位牙周再生的能力�！窘Y(jié)果】通過(guò)有限稀釋法分離獲得了人的PDLSCs和BMSCs,兩種細(xì)胞具有良好的克隆形成能力和增殖能力,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面分子,證明兩種細(xì)胞均為間充質(zhì)干細(xì)胞;通過(guò)茜素紅和油紅染色,證明兩種干細(xì)胞具有向成骨和成脂方向分化的潛能;細(xì)胞膜片包裹Ti復(fù)合HA的基因檢測(cè)結(jié)果顯示Col-I、Col-III和S100A4的表達(dá)上調(diào),雖然不是所有的納米管形貌都促進(jìn)了表達(dá)的上調(diào),但依然可以表明納米管形貌能夠促進(jìn)細(xì)胞膜片向牙周膜方向的分化;裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,納米管形貌能夠促進(jìn)復(fù)合膜片向牙周方向再生,其中在復(fù)合膜片/NT10/HA復(fù)合體表面有類(lèi)似牙骨質(zhì)樣的結(jié)構(gòu)形成,而沒(méi)有支架材料HA包裹的細(xì)胞膜片,在裸鼠體內(nèi)不能形成連續(xù)的形態(tài)結(jié)構(gòu),并且復(fù)合細(xì)胞膜片較單一來(lái)源的細(xì)胞膜片再生能力更強(qiáng)�！窘Y(jié)論】有限稀釋法分離培養(yǎng)的人PDLSCs和BMSCs具有多向分化和自我更新的潛能;納米管形貌能夠促進(jìn)復(fù)合膜片在裸鼠體內(nèi)的牙周異位再生。本課題創(chuàng)新點(diǎn):1.首次將人來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞和頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用在納米管形貌上進(jìn)行研究,明確了不同管徑的納米管形貌對(duì)兩種干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。2.構(gòu)建了不同來(lái)源的復(fù)合細(xì)胞膜片在納米管周?chē)乐茉偕哪Ｐ?并對(duì)多種來(lái)源和單一來(lái)源的細(xì)胞膜片的包裹方式相比較,明確了不同來(lái)源的復(fù)合膜片的組織再生能力更強(qiáng)。3.通過(guò)裸鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明確了納米管形貌能夠促進(jìn)牙周組織的再生,并且確定出NT10的納米管形貌更接近天然的骨組織形態(tài),為牙周再生提供了理論指導(dǎo),并顯示出一定的應(yīng)用前景。
【圖文】：

只彡哪芰�。�?1 犬牙周缺損的模型示意圖及復(fù)合物植入圖1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs 是一種來(lái)源于骨髓基質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞，既有造血的能力，又有成骨分化的能力，在一定的條件下可以分化為多種間充質(zhì)細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和成骨細(xì)胞等[16]，是臨床中應(yīng)用較多的全能干細(xì)胞。Kramer 等[17]將人的 PDLSCs 和 BMSCs 兩種干細(xì)胞共培養(yǎng) 7 天后，發(fā)現(xiàn) BMSCs中的骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達(dá)增高而骨涎蛋白的表達(dá)降低，可能是由于牙周膜干細(xì)胞誘導(dǎo)了間充質(zhì)干細(xì)胞向牙周膜方向分化，，利用這一特點(diǎn)可以更好的將 BMSCs 應(yīng)用于牙周修復(fù)及再生的研究中。Kim 等[18]將成年比格犬的 PDLSCs 和 BMSCs 聯(lián)合 HA/TCP 的復(fù)合物，植入牙槽窩內(nèi)，進(jìn)行熒光標(biāo)記 8 周后取材，結(jié)果顯示在牙槽骨處有大量的新骨形成，靠近HA/TCP 處的熒光強(qiáng)度較深，BMSCs 可以促進(jìn)骨缺損周?chē)鹿切纬�。Yang 等[19]將熒光鼠的細(xì)胞體外培養(yǎng)后

GFP+蛋白標(biāo)記新形成的牙骨質(zhì)區(qū)域
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R783.6


本文編號(hào)：2586422