【摘要】：[研究背景與目的]酒精性肝病長(zhǎng)期以來(lái)威脅著人類(lèi)的健康,初期典型的病理特征是肝細(xì)胞脂肪變性,隨著疾病的發(fā)展,肝細(xì)胞損傷繼而可能發(fā)生壞死性凋亡,進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng),該階段稱(chēng)為酒精性肝炎。隨后,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)在炎性因子刺激下活化,其活化并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)成分是肝纖維化病理進(jìn)程中的核心事件,該階段是肝纖維化階段。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)核因子 E2 相關(guān)因子 2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)與酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可能是疾病演進(jìn)的核心分子。從中藥活性成分中挖掘治療酒精性肝病的候選藥物已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本課題組長(zhǎng)期致力于研究天然活性分子姜黃素在抗肝纖維化中的作用,從體內(nèi)外兩個(gè)層面初步明確了姜黃素的抗肝纖維化藥理活性,并進(jìn)一步揭示了抑制HSC活化是姜黃素發(fā)揮藥效的重要途徑。此外,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在酒精性肝損傷方面也表現(xiàn)出較強(qiáng)的治療效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上,本論文提出姜黃素通過(guò)激活Nrf2抑制酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性從而改善脂肪肝,并通過(guò)抑制壞死性凋亡改善酒精性肝炎,進(jìn)而抑制HSC活化發(fā)揮抗酒精性肝纖維化作用的科學(xué)假說(shuō),并對(duì)此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。[研究?jī)?nèi)容與結(jié)果]本研究首先利用天狼星紅染色與組織免疫熒光檢測(cè)臨床酒精性肝纖維化患者肝臟中Nrf2與醌氧化還原酶(NAD(P)H:quinoneoxidoreductase1,NQO1)表達(dá),發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞與HSC內(nèi)Nrf2表達(dá)及活性隨著肝纖維化程度的加重而降低;建立酒精誘導(dǎo)的大鼠酒精性肝病模型并給予姜黃素治療,發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著改善酒精誘導(dǎo)的肝臟損傷、炎癥反應(yīng)以及脂肪變性,同時(shí)明顯促進(jìn)肝臟中Nrf2的表達(dá)和活性。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),姜黃素能顯著削弱乙醇誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞系L02的損傷和脂肪變性。同時(shí),姜黃素激活肝細(xì)胞內(nèi)Nrf2與法尼酯衍生物 X 受體(farnesoid X receptor,FXR)表達(dá)。采用 Nrf2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、Nrf2 siRNA、GW4064和Z-Guggulsterone探究Nrf2與FXR在姜黃素的肝細(xì)胞保護(hù)作用中的角色。研究發(fā)現(xiàn)Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與GW4064可模擬并增強(qiáng)姜黃素抑制肝細(xì)胞脂肪變性的作用,而Nrf2 siRNA與Z-Guggulsterone則削弱姜黃素的作用;Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)一步促進(jìn)姜黃素對(duì)FXR的激活作用,而Nrf2 siRNA作用相反。采用尾靜脈注射N(xiāo)rf2短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒建立Nrf2基因敲減小鼠,并進(jìn)一步建立酒精性肝病模型,研究發(fā)現(xiàn)Nrf2基因敲減在一定程度上可加重酒精誘導(dǎo)的肝臟損傷、炎癥反應(yīng)以及脂肪變性。建立酒精誘導(dǎo)的小鼠酒精性肝病模型并給予姜黃素治療,研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能劑量依賴(lài)性地抑制酒精誘導(dǎo)的肝組織中壞死性凋亡關(guān)鍵基因的表達(dá)。建立Nrf2基因敲減小鼠酒精性肝病模型并給予姜黃素治療,研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著削弱酒精誘導(dǎo)的野生小鼠的肝細(xì)胞壞死性凋亡,而姜黃素在Nrf2基因敲減小鼠中無(wú)明顯改善作用。酒精處理?xiàng)l件下,Nrf2基因敲減小鼠肝組織中p53基因表達(dá)強(qiáng)烈,并且Nrf2低表達(dá)顯著削弱姜黃素對(duì)p53基因的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Nrf2 siRNA同樣可削弱姜黃素對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)p53基因表達(dá)的抑制作用;Nrf2 siRNA盡管顯著削弱姜黃素對(duì)壞死性凋亡關(guān)鍵基因表達(dá)的抑制作用,p53 siRNA可抵抗Nrf2 siRNA的作用,恢復(fù)姜黃素對(duì)壞死性凋亡關(guān)鍵基因的抑制作用。HSC轉(zhuǎn)染Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)�；騈rf2 siRNA質(zhì)粒,檢測(cè)HSC脂肪細(xì)胞表型的變化。研究發(fā)現(xiàn)Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒促進(jìn)HSC內(nèi)脂質(zhì)生成并調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá),同時(shí)抑制HSC活化標(biāo)志基因的表達(dá),Nrf2siRNA呈現(xiàn)相反的作用。建立四氯化碳(carbontetrachloride,CC14)誘導(dǎo)的Nrf2基因敲減小鼠肝纖維化模型,研究發(fā)現(xiàn)Nrf2基因敲減在一定程度上加重CC14誘導(dǎo)的肝臟損傷、炎癥反應(yīng)以及肝纖維化癥狀,促進(jìn)HSC活化標(biāo)志基因的表達(dá)。酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)信號(hào)途徑抑制劑AG490和Stattic均能明顯恢復(fù)活化HSC的脂肪細(xì)胞表型。Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒能顯著抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路以及細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白-3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的表達(dá)。姜黃素能促進(jìn)活化HSC脂肪細(xì)胞表型的恢復(fù),并增強(qiáng)HSC內(nèi)Nrf2轉(zhuǎn)錄活性。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示Nrf2過(guò)表達(dá)質(zhì)�？稍鰪�(qiáng)姜黃素對(duì)HSC脂肪細(xì)胞表型恢復(fù)的作用,而Nrf2 siRNA可拮抗姜黃素的作用。姜黃素對(duì)CC14誘導(dǎo)的肝纖維化的改善作用在Nrf2基因敲減小鼠上收效甚微。乙醇刺激的肝細(xì)胞培養(yǎng)液可促進(jìn)HSC活化,而高遷移率族蛋白 1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)siRNA 轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后,其乙醇刺激后的培養(yǎng)液對(duì)HSC活化的誘導(dǎo)作用減弱。[結(jié)論]綜上結(jié)果表明姜黃素通過(guò)激活肝細(xì)胞內(nèi)Nrf2改善酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性以及肝細(xì)胞壞死性凋亡;姜黃素通過(guò)激活HSC內(nèi)Nrf2恢復(fù)活化HSC的脂肪細(xì)胞表型并抑制其活化;姜黃素通過(guò)抑制酒精誘導(dǎo)的壞死性凋亡的肝細(xì)胞釋放HMGB1阻斷其對(duì)HSC活化的誘導(dǎo)作用;姜黃素抑制酒精性脂肪肝-酒精性肝炎-肝纖維化的疾病演進(jìn)。本論文研究確證了Nrf2在姜黃素改善酒精性肝病中的重要作用,系統(tǒng)揭示其中的調(diào)控機(jī)制,為將姜黃素開(kāi)發(fā)為臨床酒精性肝病治療藥物提供有力證據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2560779