【摘要】：研究背景大蒜是百合科蔥屬類植物,在我國有悠久的藥用和食用歷史。流行病學研究顯示,大蒜的日常食用能減少許多癌癥的發(fā)生率。近半個多世紀以來,大蒜中各類成分在抗腫瘤方面的研究在一直處于熱點狀態(tài),目前已有部分文獻記載了眾多含硫化合物在抗癌方面的突出活性,尤其以前列腺癌的研究最為集中,其次是乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌等。據(jù)不完全統(tǒng)計,大蒜中的主要成分二烯丙基硫醚(DAS),二烯丙基二硫醚(DADS),二烯丙基三硫醚(DATS),S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)等化合物均報道過抗腫瘤方面的研究。而縱觀當前已上市的大蒜類產(chǎn)品,如大蒜精油、老蒜提取物、蒜粉膠囊和片劑,這些產(chǎn)品多作為保健品應(yīng)用,其中,大蒜精油,老蒜提取物因其混合物成分復雜,且含有的有效成分含量較低,嚴重限制了其療效的發(fā)揮。而市場上少量的大蒜類藥品也多作為抗細菌和抗真菌類藥物應(yīng)用,其市場銷售量小,未見其在如抗腫瘤等更為廣泛的臨床應(yīng)用,究其原因是缺乏更為深入且規(guī)范的研究。綜合分析現(xiàn)有文獻的研究,可總結(jié)出以下缺點:首先是對于目標化合物的選擇過于隨機。如現(xiàn)有文獻中就有報道DAS、DADS、DATS、AMDS、SAC、SAMC,甚至有黑蒜提取物、蒜粉等混合物成分的抗癌作用,少有在結(jié)構(gòu)上探討過構(gòu)效和量效關(guān)系的描述,亦少有兼顧其溶解度、穩(wěn)定性以及代謝轉(zhuǎn)化等方面的綜合考量;其次,部分研究僅僅在細胞模型評價了各類化合物的抗腫瘤效果,進而探討各類信號通路機制。由于細胞模型過于理想化,且忽略了藥物進入體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程,特別是無法評價其體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的作用;再者,偶有文獻雖兼顧了體內(nèi)動物模型的驗證,但腫瘤模型的建立過于隨意,如移植腫瘤未生長到指定大小或者剛接種即開始治療流程,甚至在給藥過程中,違背體內(nèi)研究的本意,直接將藥物注射在皮下瘤中;最后,絕大部分研究多為單一成分的體內(nèi)外抗腫瘤研究,少有聯(lián)合用藥的方案研究,且均未考慮有機硫化合物進入體內(nèi)后的吸收、代謝、分布情況。總之前期研究的不系統(tǒng)和欠規(guī)范,使得多數(shù)研究結(jié)果的應(yīng)用價值較低。本課題大蒜有機硫目標化合物以及疾病治療模型的選擇是綜合考量了化合物的活性、穩(wěn)定性、毒性以及其流行性病學的統(tǒng)計結(jié)果。前期抗腫瘤藥物構(gòu)效關(guān)系研究表明,大蒜有機硫化合物中烯丙基和硫元素是藥效官能團,其抗癌活性隨著硫元素數(shù)目的增多而增強,但其穩(wěn)定性降低、毒性也隨之增大,經(jīng)綜合考量后本課題選擇了二烯丙基三硫醚(DATS)單一成分作為化合物研究對象�？鼓[瘤應(yīng)用模型的選擇是依據(jù)流行性病學統(tǒng)計結(jié)果,大數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明日常大蒜食用在降低胃癌和肺癌發(fā)病率上均有著積極的作用。本課題的實驗設(shè)計旨在綜合體內(nèi)和體外兩個方面,對大蒜中含量較高其活性較強的DATS進行了較為深入的藥物代謝和抗腫瘤活性評價,其主要研究內(nèi)容由以下三部分組成:(1)體內(nèi)外藥物代謝研究,(2)抗胃癌和肺癌的藥效學臨床前評價,(3)與順鉑聯(lián)合應(yīng)用以降低順鉑毒副作用的初步研究。本課題彌補了前期研究的缺陷,為后期蒜類有機硫化合物藥物的開發(fā)利用提供一些有用的實驗依據(jù)。研究設(shè)計及結(jié)果(1)大蒜有機硫化合物DATS的體內(nèi)外代謝及轉(zhuǎn)化途徑研究:在藥物代謝研究方面,通過單劑量和多劑量給藥大鼠DATS,GC-MS分析顯示只在血漿中檢測到了甲基烯丙基亞砜(AMSO)和甲基烯丙基砜(AMS02)兩個代謝產(chǎn)物,并未檢測到DATS的底物峰,說明DATS在血液中代謝較快。DATS體外代謝研究采用了大鼠紅細胞模型,以HPLC技術(shù)對DATS在大鼠體外的代謝產(chǎn)物進行了定性研究,確證了烯丙基硫醇(AM)和DADS兩個主要代謝產(chǎn)物;為了解釋體內(nèi)外代謝結(jié)果的不一致性,我們對DATS代謝轉(zhuǎn)化途經(jīng)進行了更為深入的研究。綜合文獻查閱,推測化合物甲基烯丙基硫醚(AMS)可能為其中間產(chǎn)物。根據(jù)甲基化反應(yīng)原理,驗證AM先在血細胞中甲基化生成AMS,后經(jīng)由肝微粒體氧化反應(yīng)生成AMSO和AMS02。而DADS已被報道可轉(zhuǎn)化生成 AM。至此,我們得到 DATS → DADS → AM → AMS → AMSO → AMS02 的轉(zhuǎn)化路徑。在動力學方面,DATS在體內(nèi)有一個迅速的代謝過程,致使體內(nèi)研究上我們檢測不到原型藥物;但是其代謝產(chǎn)物AMSO,AMS02,在大鼠血漿中有較長的滯留時間。(2)DATS抗胃癌和肺癌的活性研究:利用體外細胞技術(shù)評價了 DATS的抗腫瘤活性,選擇SGC-7901和BGC-823作為胃癌模型,NCI-H460為肺癌模型,結(jié)果顯示DATS對這幾種腫瘤細胞均有明顯的抑制作用,其作用機制通過調(diào)節(jié)cyclin家族蛋白阻滯細胞周期、激活caspase級聯(lián)反應(yīng)、調(diào)節(jié)bcl-2家族蛋白和MAPK通路誘導細胞凋亡實現(xiàn)的;在體內(nèi)抗腫瘤評價中,通過構(gòu)建人源的腫瘤移植瘤模型,嚴格按照標準操作,即待腫瘤生長到100-200 mm3,進行分組實驗,通過評價包括腫瘤體積、相對腫瘤體積以及相對腫瘤生長率在內(nèi)的主要指標。結(jié)果顯示,與對照組相比,DATS對肺癌和胃癌移植瘤均有明顯的抑制作用,并且裸鼠體重無明顯的降低現(xiàn)象。然而,經(jīng)計算DATS在各腫瘤上的相對腫瘤增長率T/C(%)值,其均未達到低于40%的規(guī)范要求,說明DATS雖然具有一定的抗胃癌和肺癌效果,有可能需要與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。通過觀察陽性對照順鉑(DDP)組后,發(fā)現(xiàn)DDP給藥5mg/kg,雖然能達到腫瘤的抑制標準,但是其體重有顯著性降低,從側(cè)面說明DDP對機體的損傷嚴重。鑒于蒜類化合物獨有的機體防護作用的特點,本課題設(shè)計了DDP和DATS聯(lián)合治療方案,結(jié)果顯示,DATS不僅具有增強DDP療效的作用,而且DATS聯(lián)用明顯抑制了 DDP單用時引起的體重降低的現(xiàn)象。(3)DATS及其活性代謝產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)順鉑誘發(fā)的腎毒性研究:順鉑在臨床上存在多種副作用,其中腎毒性是臨床中十分常見的不良反應(yīng)。因此,本部分著重研究DATS聯(lián)合DDP在改善腎毒方面的積極作用。通過構(gòu)建DDP誘發(fā)的BALb/c小鼠腎損傷模型,研究DATS對其防治作用,結(jié)果顯示,DATS預處理給藥后,有效降低DDP引起的腎功能異常,如調(diào)節(jié)炎癥因子的表達,修復腎組織中腎小管周圍的損傷和炎癥。在機制研究方面,選擇人腎小管上皮細胞HK-2作為體外模型,經(jīng)細胞活力檢測顯示DATS在體外研究中不具備保護腎細胞的作用。考慮DATS進入體內(nèi)后形成的其他代謝產(chǎn)物。經(jīng)過GC-MS檢測全血樣本和腎組織勻漿樣本,確認血液、腎組織中均存在一定量的AMS02。由此本課題以AMS02作為研究目標,細胞活性實驗表明其對HK-2細胞基本沒有殺傷作用,且聯(lián)用DDP后,能明顯增加細胞活率。此外,AMS02可有效的調(diào)節(jié)caspase蛋白減少細胞凋亡的發(fā)生,顯著抑制炎癥介質(zhì)COX-2的產(chǎn)生,以及調(diào)節(jié)MAPK(包括ERK,JNK,p38)和NFκB通路減少細胞內(nèi)ROS的異常積累,這些均是AMS02緩解DDP對HK-2細胞毒性損傷的重要機制。此外,在驗證MAPK特異性抑制劑的作用時,以JNK和ERK的抑制劑有明顯的增加細胞活率和降低細胞凋亡發(fā)生的作用。由此說明,JNK和ERK可能是AMS02發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子。結(jié)論本課題綜合利用體內(nèi)外多種代謝模型研究了 DATS的生物轉(zhuǎn)化路徑,并鑒定了主要代謝產(chǎn)物;DATS的體外和裸鼠體內(nèi)抗腫瘤活性規(guī)范化研究結(jié)果表明其抗胃癌和肺癌的療效沒有達到相對腫瘤增長率T/C(%)值低于40%的規(guī)范要求;依據(jù)DATS抗腫瘤作用特點,本課題創(chuàng)造性地提出了聯(lián)合順鉑給藥的治療方案,并驗證了 DATS在提高順鉑療效方面的積極作用;最后,探究了 DATS在緩解順鉑誘發(fā)腎毒性方面的積極作用;同時發(fā)現(xiàn)了 DATS活性代謝產(chǎn)物AMS02降低腎毒性方面的作用。本研究為大蒜類有機硫化合物的進一步藥用開放提供了藥物代謝和藥效學方面的理論和實驗參考數(shù)據(jù)。
【圖文】：

邋、、邋ＡＡ邋、－逡逑圖２－邋２大鼠連續(xù)給藥ＤＡＴＳ邋５天后于第６邋ｈ的血漿樣品的ＧＣ－ＭＳ總寓子流圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－邋２邋ＧＣ－ＭＳ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍａ邋ｓａｍｐｌｅ邋ｏｆ邋６ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ｏｒａＵｙ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ邋ｏｆ邋ｍｕｌｔｉｐｌｅ逡逑ｄｏｓｅｏｆ５０ｍｇ／ｋｇＤＡＴＳｆｏｒ５ｄａｙｓ邋（見實驗記錄邋Ｎ0．０００４７＊７５－ｐ８９）逡逑通過對Ｍｌ和Ｍ２未知代謝物進行質(zhì)譜庫匹配檢索，其９．３ｍｉｎ及１０．７ｍｉｎ的逡逑代謝峰分別對應(yīng)的質(zhì)譜圖如下，圖２－３所示。逡逑１００－邐４１邐］00－邐４１逡逑？逡逑５０－邐日邋0邐＊？逡逑４５邐１０４逡逑６３逡逑0１邋ｉＪｊＬＪｉ，，，。Ｊ＾邐Ｊ＿＿Ｉ，ｉｌｌ．１＾．甲邐Ｉｆ逡逑２０邐４０邐６０邋ＨＯ邋１００邐：況邐樹）邐ｇ（）邐１２０逡逑圖２－３未知代謝物Ｍｌ和Ｍ２的質(zhì)譜峰（左圖Ｍｌ，右圖Ｍ２）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｍ化Ｓ邋ｓｐｅｃｔｉ．ｏｇｉ．ａｍｓ邋ｏｆ邋化ｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ邋Ｍ］邋（ｌｅ巧邋ａｎｄ邋Ｍ２邋（ｒｉｇｈｔ）（見實驗記錄逡逑Ｎｏ．０００４７７５－ｐ８９）逡逑經(jīng)標準譜庫分析和質(zhì)譜圖碎片峰比對，確認９．３ｍｉｎ代謝峰Ｍｌ為甲基Zf丙逡逑基亞諷（ＡＭＳＯ），１０．７ｍｉｎ的代謝峰Ｍ２為甲基Zf丙基諷（ＡＭＳ０２），，結(jié)構(gòu)如下：逡逑３５逡逑

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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2550738