本文選題：食管鱗狀細胞癌 + Shp2　； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景和目的食管癌是一種發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率常年居高不下。食管鱗狀細胞癌和食管腺癌分別是食管癌最主要的兩大組織類型。在我國的食管癌病例中,絕大多數(shù)表現(xiàn)為食管鱗狀細胞癌,食管腺癌則相對罕見。食管癌患者早期癥狀不明顯,就診時多已進展至為中晚期。因此食管癌病變發(fā)生初期的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療已成為目前臨床和基礎(chǔ)的重要研究課題。目前,除了依靠臨床診斷、手術(shù)等治療水平的提高,以基因靶向治療為核心生物治療可能成為重要的治療方向。然而,食管癌缺乏特異性治療靶標而無法獲得良好效果。因此,本研究試圖通過深入探索食管癌發(fā)病機制,尋找可能的基因靶點,為食管癌的靶向治療提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。Shp2分子發(fā)現(xiàn)于20世紀90年代早期,是一種帶有兩個SH2結(jié)構(gòu)域的非受體型酪氨酸磷酸酶。Shp2通過與多種信號通路交互,在細胞增殖、分化等方面發(fā)揮作用。在腫瘤研究領(lǐng)域,人們最先在白血病中闡述了Shp2分子的原癌基因作用。近年來,人們逐步開始探究Shp2分子在實體瘤中所發(fā)揮的作用。研究者相繼報道了Shp2分子與乳腺癌、胃癌、肺癌等實體腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的密切聯(lián)系。初步的成果揭示了,Shp2分子通過對多種腫瘤信號通路的激活,在腫瘤中發(fā)揮原癌基因作用。同時多個文獻報道了Shp2在部分腫瘤發(fā)生發(fā)展中的抑癌作用,提示Shp2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有兩面性。但在食管癌中,Shp2的作用及其機制尚未明確。本課題試圖通過一系列臨床標本檢測及細胞功能學研究,觀察Shp2在食管鱗狀細胞癌中的表達變化及其在食管鱗癌細胞生物學功能中的作用,并進一步探究Shp2影響食管鱗狀細胞癌生物學功能的潛在機制。同時通過分析Shp2在食管鱗癌細胞化療耐藥性中的作用,探討Shp2在食管鱗癌聯(lián)合化療中的價值,最終為食管鱗癌治療提供新的靶點。研究方法1.免疫組織化學染色檢測食管鱗狀細胞癌組織及對應(yīng)癌旁組織石蠟標本中Shp2蛋白表達水平,分析不同組織中Shp2蛋白表達差異;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blot)檢測食管鱗狀細胞癌及對應(yīng)癌旁正常組織的新鮮組織標本中Shp2蛋白表達水平,分析癌組織中Shp2蛋白表達量變化;提取美國癌癥基因組圖譜計劃(TCGA)數(shù)據(jù)庫中食管鱗狀細胞癌Shp2表達數(shù)據(jù)與預后信息,分析Shp2表達水平與患者預后之間的聯(lián)系;2.使用慢病毒系統(tǒng)介導的Shp2-shRNA轉(zhuǎn)染食管鱗狀細胞癌Eca109細胞株,干擾Eca109細胞中Shp2表達,分別建立Eca109對照組(Control)和Shp2干擾組(shShp2)穩(wěn)定細胞系;Western-blot檢測Eca109細胞Control組及shShp2組Shp2蛋白表達變化,驗證轉(zhuǎn)染效率;對Eca109細胞Control組及shShp2組進行CCK-8檢測試驗、克隆形成實驗檢測Shp2干擾對Eca109細胞體外增殖、克隆形成能力的影響;Eca109細胞Control組及shShp2組進行裸鼠皮下成瘤實驗,觀察Shp2干擾對Eca109細胞體內(nèi)成瘤能力及移植瘤體內(nèi)生長的影響;3.順鉑分別處理Control組及shShp2組Eca109細胞,CCK-8試驗分別檢測順鉑用藥24、48、72、96小時后細胞活力,分析Shp2干擾對Eca109化療耐藥性的影響;順鉑、5-氟尿嘧啶分別處理Control組及shShp2組Eca109細胞,Annexin V凋亡檢測試劑盒處理后流式檢測分析Shp2在化療誘導的細胞凋亡中的作用;Western-blot檢測Control組及shShp2組Eca109細胞化療耐藥相關(guān)基因ABCG2、Nanog表達水平,分析Shp2表達影響Eca109化療耐藥性的潛在分子機制;Transwell遷移試驗分析Shp2表達干擾對食管鱗癌細胞遷移能力的影響;4.Western-blot和免疫組織化學染色檢測Eca109細胞及裸鼠移植瘤Shp2干擾對下游信號Stat3磷酸化(p-Stat3)水平的影響;免疫組織化學染色檢測人食管鱗狀細胞癌組織標本中Shp2蛋白表達與Stat3磷酸化水平,分析Shp2表達與p-Stat3磷酸化之間的聯(lián)系;Real time-PCR檢測Control組及shShp2組Stat3下游靶基因Cyclin D1、Survivin表達水平,分析Shp2干擾后Eca109細胞相關(guān)基因表達變化。研究結(jié)果1.食管鱗狀細胞癌組織免疫組化檢測顯示Shp2蛋白表達水平低于對應(yīng)癌旁組織,組織蛋白Western-blot檢測顯示食管鱗狀細胞癌中Shp2蛋白表達量低于癌旁正常組織,提示食管鱗癌組織中Shp2表達顯著降低,提示Shp2低表達可能與食管鱗狀細胞癌發(fā)生密切相關(guān);對TCGA數(shù)據(jù)庫中食管鱗狀細胞癌患者預后資料進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示Shp2低表達組患者總體生存期顯著差于高表達組,提示Shp2低表達與食管鱗狀細胞癌預后有關(guān);2.成功建立食管鱗狀細胞癌Eca109細胞株Shp2干擾穩(wěn)定細胞系,Shp2干擾提高了Eca109細胞的體外增殖能力及克隆形成能力,提示Shp2可能在食管鱗癌細胞體外中發(fā)揮抑制作用;通過裸鼠皮下成瘤實驗,發(fā)現(xiàn)Shp2干擾可以顯著增強Eca109細胞在裸鼠體內(nèi)的增殖速度,提示Shp2表達抑制了食管鱗癌細胞的體內(nèi)增殖能力;3.順鉑藥物毒性實驗發(fā)現(xiàn)Shp2干擾可以提高Eca109的生存能力;流式凋亡檢測發(fā)現(xiàn)Shp2干擾后Eca109細胞凋亡抑制,對順鉑、5-氟尿嘧啶耐藥性增強;Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)Shp2干擾細胞系中ABCG2、Nanog表達水平顯著上調(diào);Transwell遷移試驗發(fā)現(xiàn)Shp2表達對細胞遷移能力沒有顯著影響。4.通過對Shp2干擾Eca109細胞系及對照細胞系p-Stat3水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)Shp2干擾后p-Stat3水平明顯上調(diào);對裸鼠移植瘤進行連續(xù)切片免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)Shp2低表達區(qū)域p-Stat3水平上調(diào),反之Shp2高表達區(qū)域p-Stat3水平下調(diào),提示Shp2可能通過抑制Stat3磷酸化發(fā)揮作用;同樣的,對食管鱗狀細胞癌標本中Shp2表達與Stat3磷酸化(p-Stat3)水平分析發(fā)現(xiàn),Shp2表達與p-Stat3水平呈負相關(guān);Real time-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Shp2干擾后Eca109細胞中Stat3下游靶基因Cyclin D1、Survivin表達水平顯著上調(diào)。結(jié)論:綜合Shp2在腫瘤中的多項研究,我們發(fā)現(xiàn)Shp2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用具有兩面性——在部分腫瘤中發(fā)揮促癌作用同時在一些腫瘤中抑制腫瘤生長,但Shp2在食管鱗狀細胞癌中的作用尚無研究報道。本課題研究發(fā)現(xiàn)Shp2在食管鱗狀細胞癌組織中表達低于癌旁正常組織,并且食管鱗狀細胞癌中Shp2低表達與患者預后較差顯著相關(guān),提示Shp2在食管鱗狀細胞中可能發(fā)揮抑癌作用。細胞功能學研究顯示Shp2抑制了食管鱗癌細胞的體外增殖能力、克隆形成能力及體內(nèi)移植瘤生長速度。另外,Shp2抑制食管鱗癌細胞化療抵抗相關(guān)基因表達,促進化療誘導的細胞凋亡,顯著降低食管鱗癌細胞的化療耐藥性。Shp2對食管鱗癌細胞遷移能力無顯著影響。Shp2干擾細胞系中發(fā)現(xiàn)Stat3磷酸化水平顯著增高以及Stat3靶基因表達上調(diào),提示在食管鱗癌中Shp2通過對Stat3的去磷酸化并下調(diào)靶基因表達發(fā)揮抑制作用。綜上所述,Shp2在食管鱗癌發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用,可能是食管鱗癌的預后標志物和潛在臨床治療靶點。
[Abstract]:In the field of cancer research , the role of Shp2 in the development of esophageal squamous cell carcinoma and the role of Shp2 on the biological function of esophageal squamous cell carcinoma were discussed . The expression level of Shp2 protein in esophageal squamous cell carcinoma was analyzed by Western - blot and immunohistochemistry staining . The results showed that Shp2 could inhibit the proliferation of Eca109 cells in vitro . Shp2 inhibited the expression of Stat3 in esophageal squamous cell carcinoma and decreased the expression of Stat3 target gene . In conclusion , Shp2 inhibited the expression of Stat3 and decreased the expression of Stat3 target gene .

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

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本文編號：1830753