本文選題：食管鱗狀細(xì)胞癌 + Shp2　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景和目的食管癌是一種發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率常年居高不下。食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌分別是食管癌最主要的兩大組織類型。在我國(guó)的食管癌病例中,絕大多數(shù)表現(xiàn)為食管鱗狀細(xì)胞癌,食管腺癌則相對(duì)罕見。食管癌患者早期癥狀不明顯,就診時(shí)多已進(jìn)展至為中晚期。因此食管癌病變發(fā)生初期的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療已成為目前臨床和基礎(chǔ)的重要研究課題。目前,除了依靠臨床診斷、手術(shù)等治療水平的提高,以基因靶向治療為核心生物治療可能成為重要的治療方向。然而,食管癌缺乏特異性治療靶標(biāo)而無法獲得良好效果。因此,本研究試圖通過深入探索食管癌發(fā)病機(jī)制,尋找可能的基因靶點(diǎn),為食管癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。Shp2分子發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)90年代早期,是一種帶有兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域的非受體型酪氨酸磷酸酶。Shp2通過與多種信號(hào)通路交互,在細(xì)胞增殖、分化等方面發(fā)揮作用。在腫瘤研究領(lǐng)域,人們最先在白血病中闡述了Shp2分子的原癌基因作用。近年來,人們逐步開始探究Shp2分子在實(shí)體瘤中所發(fā)揮的作用。研究者相繼報(bào)道了Shp2分子與乳腺癌、胃癌、肺癌等實(shí)體腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的密切聯(lián)系。初步的成果揭示了,Shp2分子通過對(duì)多種腫瘤信號(hào)通路的激活,在腫瘤中發(fā)揮原癌基因作用。同時(shí)多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道了Shp2在部分腫瘤發(fā)生發(fā)展中的抑癌作用,提示Shp2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有兩面性。但在食管癌中,Shp2的作用及其機(jī)制尚未明確。本課題試圖通過一系列臨床標(biāo)本檢測(cè)及細(xì)胞功能學(xué)研究,觀察Shp2在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)變化及其在食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用,并進(jìn)一步探究Shp2影響食管鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)功能的潛在機(jī)制。同時(shí)通過分析Shp2在食管鱗癌細(xì)胞化療耐藥性中的作用,探討Shp2在食管鱗癌聯(lián)合化療中的價(jià)值,最終為食管鱗癌治療提供新的靶點(diǎn)。研究方法1.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織石蠟標(biāo)本中Shp2蛋白表達(dá)水平,分析不同組織中Shp2蛋白表達(dá)差異;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織的新鮮組織標(biāo)本中Shp2蛋白表達(dá)水平,分析癌組織中Shp2蛋白表達(dá)量變化;提取美國(guó)癌癥基因組圖譜計(jì)劃(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中食管鱗狀細(xì)胞癌Shp2表達(dá)數(shù)據(jù)與預(yù)后信息,分析Shp2表達(dá)水平與患者預(yù)后之間的聯(lián)系;2.使用慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)的Shp2-shRNA轉(zhuǎn)染食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞株,干擾Eca109細(xì)胞中Shp2表達(dá),分別建立Eca109對(duì)照組(Control)和Shp2干擾組(shShp2)穩(wěn)定細(xì)胞系;Western-blot檢測(cè)Eca109細(xì)胞Control組及shShp2組Shp2蛋白表達(dá)變化,驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;對(duì)Eca109細(xì)胞Control組及shShp2組進(jìn)行CCK-8檢測(cè)試驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Shp2干擾對(duì)Eca109細(xì)胞體外增殖、克隆形成能力的影響;Eca109細(xì)胞Control組及shShp2組進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),觀察Shp2干擾對(duì)Eca109細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力及移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響;3.順鉑分別處理Control組及shShp2組Eca109細(xì)胞,CCK-8試驗(yàn)分別檢測(cè)順鉑用藥24、48、72、96小時(shí)后細(xì)胞活力,分析Shp2干擾對(duì)Eca109化療耐藥性的影響;順鉑、5-氟尿嘧啶分別處理Control組及shShp2組Eca109細(xì)胞,Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒處理后流式檢測(cè)分析Shp2在化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用;Western-blot檢測(cè)Control組及shShp2組Eca109細(xì)胞化療耐藥相關(guān)基因ABCG2、Nanog表達(dá)水平,分析Shp2表達(dá)影響Eca109化療耐藥性的潛在分子機(jī)制;Transwell遷移試驗(yàn)分析Shp2表達(dá)干擾對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響;4.Western-blot和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Eca109細(xì)胞及裸鼠移植瘤Shp2干擾對(duì)下游信號(hào)Stat3磷酸化(p-Stat3)水平的影響;免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)人食管鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本中Shp2蛋白表達(dá)與Stat3磷酸化水平,分析Shp2表達(dá)與p-Stat3磷酸化之間的聯(lián)系;Real time-PCR檢測(cè)Control組及shShp2組Stat3下游靶基因Cyclin D1、Survivin表達(dá)水平,分析Shp2干擾后Eca109細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)變化。研究結(jié)果1.食管鱗狀細(xì)胞癌組織免疫組化檢測(cè)顯示Shp2蛋白表達(dá)水平低于對(duì)應(yīng)癌旁組織,組織蛋白Western-blot檢測(cè)顯示食管鱗狀細(xì)胞癌中Shp2蛋白表達(dá)量低于癌旁正常組織,提示食管鱗癌組織中Shp2表達(dá)顯著降低,提示Shp2低表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生密切相關(guān);對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示Shp2低表達(dá)組患者總體生存期顯著差于高表達(dá)組,提示Shp2低表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后有關(guān);2.成功建立食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞株Shp2干擾穩(wěn)定細(xì)胞系,Shp2干擾提高了Eca109細(xì)胞的體外增殖能力及克隆形成能力,提示Shp2可能在食管鱗癌細(xì)胞體外中發(fā)揮抑制作用;通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Shp2干擾可以顯著增強(qiáng)Eca109細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖速度,提示Shp2表達(dá)抑制了食管鱗癌細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力;3.順鉑藥物毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Shp2干擾可以提高Eca109的生存能力;流式凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Shp2干擾后Eca109細(xì)胞凋亡抑制,對(duì)順鉑、5-氟尿嘧啶耐藥性增強(qiáng);Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Shp2干擾細(xì)胞系中ABCG2、Nanog表達(dá)水平顯著上調(diào);Transwell遷移試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Shp2表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力沒有顯著影響。4.通過對(duì)Shp2干擾Eca109細(xì)胞系及對(duì)照細(xì)胞系p-Stat3水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Shp2干擾后p-Stat3水平明顯上調(diào);對(duì)裸鼠移植瘤進(jìn)行連續(xù)切片免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)Shp2低表達(dá)區(qū)域p-Stat3水平上調(diào),反之Shp2高表達(dá)區(qū)域p-Stat3水平下調(diào),提示Shp2可能通過抑制Stat3磷酸化發(fā)揮作用;同樣的,對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中Shp2表達(dá)與Stat3磷酸化(p-Stat3)水平分析發(fā)現(xiàn),Shp2表達(dá)與p-Stat3水平呈負(fù)相關(guān);Real time-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Shp2干擾后Eca109細(xì)胞中Stat3下游靶基因Cyclin D1、Survivin表達(dá)水平顯著上調(diào)。結(jié)論:綜合Shp2在腫瘤中的多項(xiàng)研究,我們發(fā)現(xiàn)Shp2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用具有兩面性——在部分腫瘤中發(fā)揮促癌作用同時(shí)在一些腫瘤中抑制腫瘤生長(zhǎng),但Shp2在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用尚無研究報(bào)道。本課題研究發(fā)現(xiàn)Shp2在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)低于癌旁正常組織,并且食管鱗狀細(xì)胞癌中Shp2低表達(dá)與患者預(yù)后較差顯著相關(guān),提示Shp2在食管鱗狀細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌作用。細(xì)胞功能學(xué)研究顯示Shp2抑制了食管鱗癌細(xì)胞的體外增殖能力、克隆形成能力及體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)速度。另外,Shp2抑制食管鱗癌細(xì)胞化療抵抗相關(guān)基因表達(dá),促進(jìn)化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,顯著降低食管鱗癌細(xì)胞的化療耐藥性。Shp2對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力無顯著影響。Shp2干擾細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)Stat3磷酸化水平顯著增高以及Stat3靶基因表達(dá)上調(diào),提示在食管鱗癌中Shp2通過對(duì)Stat3的去磷酸化并下調(diào)靶基因表達(dá)發(fā)揮抑制作用。綜上所述,Shp2在食管鱗癌發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用,可能是食管鱗癌的預(yù)后標(biāo)志物和潛在臨床治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:In the field of cancer research , the role of Shp2 in the development of esophageal squamous cell carcinoma and the role of Shp2 on the biological function of esophageal squamous cell carcinoma were discussed . The expression level of Shp2 protein in esophageal squamous cell carcinoma was analyzed by Western - blot and immunohistochemistry staining . The results showed that Shp2 could inhibit the proliferation of Eca109 cells in vitro . Shp2 inhibited the expression of Stat3 in esophageal squamous cell carcinoma and decreased the expression of Stat3 target gene . In conclusion , Shp2 inhibited the expression of Stat3 and decreased the expression of Stat3 target gene .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：1830753