本文選題：抗菌肽 + 正電荷氨基酸��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：抗菌肽(AMPs)廣泛存在于動物、植物以及各種微生物中,他們在宿主的先天免疫防御系統(tǒng)中起重要作用。大多數(shù)抗菌肽整體上帶有正電荷(通常為2至9個),由10-50個氨基酸殘基組成,并且其序列中含有一定比例的疏水性氨基酸殘基(通�！�30%)�？咕脑谝患壗Y(jié)構(gòu)上各不相同,但二級結(jié)構(gòu)上大多數(shù)抗菌肽屬于α-螺旋肽或β-折疊肽�？咕呐c細(xì)胞膜接觸時可折疊成兩親性構(gòu)象,其帶正電荷的親水面與細(xì)菌細(xì)胞膜中帶負(fù)電荷的磷脂頭部基團(tuán)通過靜電相互作用結(jié)合,然后,其疏水面通過疏水作用插入脂質(zhì)雙分子層中,破壞細(xì)胞膜的屏障功能,最終裂解細(xì)胞膜。抗菌肽不僅能夠作用于微生物細(xì)胞膜,還能夠裂解真核細(xì)胞的細(xì)胞膜,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,這阻礙了其臨床應(yīng)用。通過不同方法來降低抗菌肽對真核細(xì)胞的毒性、提高抗菌肽對細(xì)菌的選擇性毒性是目前研究的熱點之一。此外,抗菌肽還被用于陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染應(yīng)用中,它能裂解酸性條件下的溶酶體膜從而增加轉(zhuǎn)染復(fù)合物從溶酶體的釋放,進(jìn)而增強(qiáng)陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率,增加多肽在酸性條件下的膜裂解活性是其作為轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑的必要條件。因此我們的研究目的有兩個,一方面是通過對天然抗菌肽進(jìn)行氨基酸殘基替換,獲得對真核細(xì)胞毒性低而對細(xì)菌選擇性毒性高的多肽,以便于其臨床抗細(xì)菌感染的應(yīng)用;另一方面,通過對天然抗菌肽進(jìn)行氨基酸殘基替換來設(shè)計在酸性條件下膜裂解活性較強(qiáng)而在中性條件下細(xì)胞毒性較低的多肽,用于增強(qiáng)陽離子聚合物的轉(zhuǎn)染效率。一、正電荷氨基酸殘基對抗菌肽選擇性毒性的影響。我們首先通過對含有不同正電荷氨基酸殘基數(shù)的RV-23、AR-23和melittin三個天然抗菌肽進(jìn)行對比研究,探索正電荷氨基酸殘基對抗菌肽物理特征及其對細(xì)菌和真核細(xì)胞膜的結(jié)合和裂解能力的影響。我們對比了三個抗菌肽的物理參數(shù),例如螺旋性、疏水性和兩親性,同時檢測了三個抗菌肽的抑菌活性和真核細(xì)胞毒性�？紤]到抗菌肽可能應(yīng)用于人體,我們還評價了抗菌肽的血液相容性,我們研究了三個抗菌肽對血液關(guān)鍵成分如紅細(xì)胞和血小板的影響,還通過血栓彈力圖評價了抗菌肽對凝血纖溶系統(tǒng)的整體影響。其次,我們以AR-23為模板,用帶正電荷的氨基酸殘基(Arg或Lys)取代其第1、8、或/和17位上不帶電荷的氨基酸殘基,設(shè)計了一系列AR-23改構(gòu)肽,用來研究正電荷氨基酸殘基的數(shù)目和分布對抗菌肽選擇性毒性的影響。我們測定了改構(gòu)肽在水溶液和不同膜模擬環(huán)境中的二級結(jié)構(gòu),評價了改構(gòu)肽的抑菌活性和抗生物膜活性以及改構(gòu)肽的溶血活性和對L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性,并初步探索了改構(gòu)肽破壞細(xì)胞膜的機(jī)制。結(jié)果顯示,三個天然抗菌肽均具有良好的抑菌活性,同時,具有較多正電荷氨基酸殘基的RV-23對細(xì)菌的選擇性毒性較高,具有最高的治療指數(shù),三個抗菌肽均具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu),其中RV-23的α-螺旋含量最低,這可能與其真核細(xì)胞毒性低有關(guān),同時RV-23的疏水性也較低,因為高疏水性和高α-螺旋含量可能與抗菌肽的高溶血活性相關(guān),因此,RV-23對細(xì)菌的選擇性毒性高可能是由于其疏水性和α-螺旋性均較低。RV-23不僅對細(xì)菌的選擇性毒性較高,其對血液成分如紅細(xì)胞、血小板的影響也較小,對凝血纖溶系統(tǒng)的功能基本沒有影響。正電荷氨基酸殘基的位置對抗菌肽的選擇性毒性影響較大,用帶正電荷的賴氨酸殘基取代AR-23疏水面上第17位異亮氨酸殘基能明顯改變多肽的疏水性、兩親性、螺旋性以及其溶血活性,然而,在親水面上用帶正電荷的氨基酸殘基進(jìn)行取代,對AR-23的物理性質(zhì)和生物活性影響較小。在AR-23疏水面上進(jìn)行取代能夠在保持其裂解細(xì)菌細(xì)胞膜活性的同時減少其對真核細(xì)胞膜的粘附和破壞。改構(gòu)肽A8(第1、8和17位殘基均被帶正電荷的氨基酸殘基取代)對細(xì)菌的選擇性毒性最高,真核細(xì)胞毒性最低,同時A8還具有一定的抗生物膜能力。二、電荷對抗菌肽在酸性條件下膜裂解活性的影響及其增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染效率的作用研究。在這部分實驗中,我們通過將melittin和RV-23序列中帶正電荷的氨基酸殘基全部替換成帶負(fù)電荷的谷氨酸殘基來設(shè)計pH敏感肽,用于增強(qiáng)陽離子聚合物基因遞送載體的遞送效率,通過溶血實驗和鈣黃綠素釋放實驗,我們對比了谷氨酸殘基替換后的改構(gòu)肽在中性和酸性pH條件下的膜裂解活性,檢測了帶負(fù)電荷的改構(gòu)肽對陽離子遞送載體聚乙烯亞胺(PEI)/質(zhì)粒DNA復(fù)合物物理特征的影響,同時檢測了改構(gòu)肽對PEI/寡核苷酸(ODN)在細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)挠绊?最后我們評價了改構(gòu)肽增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率的能力及其細(xì)胞毒性。此外,我們還對AR-23帶正電荷的氨基酸殘基用谷氨酸殘基進(jìn)行系統(tǒng)地替換,研究抗菌肽谷氨酸殘基數(shù)對其pH敏感性的影響,同樣的我們通過溶血實驗和鈣黃綠素釋放實驗檢測了多肽凈電荷數(shù)對其在酸性pH條件下膜裂解活性的影響,還評價了不同谷氨酸殘基數(shù)的多肽對聚賴氨酸(PLL)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率和對PLL/寡核苷酸(ODN)在細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)挠绊�。結(jié)果顯示,谷氨酸殘基替換后的抗菌肽在酸性pH條件下具有較高的α-螺旋率及較高的膜裂解活性,而在中性環(huán)境中的膜裂解能力顯著降低。谷氨酸殘基替換后的改構(gòu)肽不影響PEI縮合質(zhì)粒DNA的能力,而對PEI/DNA復(fù)合物的粒徑和zeta-電位有明顯的影響,透視電鏡顯示摻入改構(gòu)肽的PEI/DNA復(fù)合物聚團(tuán)、呈不規(guī)則的大顆粒。將改構(gòu)肽摻入PEI/ODN復(fù)合物能明顯增強(qiáng)FITC-ODN釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),同時能夠增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率,而且僅少量增加PEI的細(xì)胞毒性�？咕墓劝彼釟埢鶖�(shù)對其pH敏感性的影響較大。對AR-23而言,只有當(dāng)谷氨酸殘基數(shù)多于兩個時,其在酸性pH條件下的膜裂解活性才較高,只有含3個谷氨酸殘基的改構(gòu)肽增強(qiáng)PLL的轉(zhuǎn)染效率才較明顯,其增強(qiáng)PLL轉(zhuǎn)染效率的潛能高于常用的氯喹,并且產(chǎn)生的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于氯喹。綜上所述,一方面通過對天然抗菌肽進(jìn)行正電荷氨基酸替換,我們獲得了對細(xì)菌選擇性毒性高而對真核細(xì)胞毒性較低的合成肽,這有利于抗菌肽的臨床應(yīng)用。另一方面通過用谷氨酸殘基替換天然抗菌肽正電荷氨基酸殘基,我們獲得了在酸性條件下膜裂解活性較高的多肽,這類多肽可作為增強(qiáng)劑用于增強(qiáng)陽離子聚合物的轉(zhuǎn)染效率。本研究為推進(jìn)抗菌肽的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In addition , the antibacterial peptide can be used in cationic polymer - mediated transfection applications .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R978

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 劉建平,馬旭,翁凌驤;軟膠囊崩解遲緩現(xiàn)象機(jī)理的初步研究[J];中國醫(yī)藥工業(yè)雜志;2005年02期

2 蔣春雷,徐荻,曹蕾,路長林,劉新垣;白細(xì)胞介素2鎮(zhèn)痛功能位點氨基酸殘基相對空間位置的重要性研究[J];中國免疫學(xué)雜志;1998年02期

3 王玉琛;汪壽耄;;人血紅蛋白α、β和γ鏈中相鄰氨基酸殘基之間的聯(lián)系性問題[J];吉林醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1964年03期

4 陳樹儒;心房肽基因[J];氨基酸雜志;1989年01期

5 吳海嘯,劉志宏,馬擁軍,徐瑞龍,譚建明;人類白細(xì)胞抗原-氨基酸殘基配型標(biāo)準(zhǔn)在腎移植中的臨床應(yīng)用[J];浙江醫(yī)學(xué);2004年09期

6 潘薇,錢高潮;凝血酶調(diào)節(jié)蛋白N端155個氨基酸殘基的原核表達(dá)[J];徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年04期

7 洪曉順;;人促紅細(xì)胞生成素現(xiàn)況[J];中國新藥雜志;1993年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 翟從R，

本文編號：1829712