本文選題：抗菌肽 + 正電荷氨基酸�。� 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年博士論文

【摘要】：抗菌肽(AMPs)廣泛存在于動物、植物以及各種微生物中,他們在宿主的先天免疫防御系統(tǒng)中起重要作用。大多數抗菌肽整體上帶有正電荷(通常為2至9個),由10-50個氨基酸殘基組成,并且其序列中含有一定比例的疏水性氨基酸殘基(通�！�30%)�？咕脑谝患壗Y構上各不相同,但二級結構上大多數抗菌肽屬于α-螺旋肽或β-折疊肽�？咕呐c細胞膜接觸時可折疊成兩親性構象,其帶正電荷的親水面與細菌細胞膜中帶負電荷的磷脂頭部基團通過靜電相互作用結合,然后,其疏水面通過疏水作用插入脂質雙分子層中,破壞細胞膜的屏障功能,最終裂解細胞膜�？咕牟粌H能夠作用于微生物細胞膜,還能夠裂解真核細胞的細胞膜,產生細胞毒性,這阻礙了其臨床應用。通過不同方法來降低抗菌肽對真核細胞的毒性、提高抗菌肽對細菌的選擇性毒性是目前研究的熱點之一。此外,抗菌肽還被用于陽離子聚合物介導的轉染應用中,它能裂解酸性條件下的溶酶體膜從而增加轉染復合物從溶酶體的釋放,進而增強陽離子聚合物介導的轉染效率,增加多肽在酸性條件下的膜裂解活性是其作為轉染增強劑的必要條件。因此我們的研究目的有兩個,一方面是通過對天然抗菌肽進行氨基酸殘基替換,獲得對真核細胞毒性低而對細菌選擇性毒性高的多肽,以便于其臨床抗細菌感染的應用;另一方面,通過對天然抗菌肽進行氨基酸殘基替換來設計在酸性條件下膜裂解活性較強而在中性條件下細胞毒性較低的多肽,用于增強陽離子聚合物的轉染效率。一、正電荷氨基酸殘基對抗菌肽選擇性毒性的影響。我們首先通過對含有不同正電荷氨基酸殘基數的RV-23、AR-23和melittin三個天然抗菌肽進行對比研究,探索正電荷氨基酸殘基對抗菌肽物理特征及其對細菌和真核細胞膜的結合和裂解能力的影響。我們對比了三個抗菌肽的物理參數,例如螺旋性、疏水性和兩親性,同時檢測了三個抗菌肽的抑菌活性和真核細胞毒性�？紤]到抗菌肽可能應用于人體,我們還評價了抗菌肽的血液相容性,我們研究了三個抗菌肽對血液關鍵成分如紅細胞和血小板的影響,還通過血栓彈力圖評價了抗菌肽對凝血纖溶系統(tǒng)的整體影響。其次,我們以AR-23為模板,用帶正電荷的氨基酸殘基(Arg或Lys)取代其第1、8、或/和17位上不帶電荷的氨基酸殘基,設計了一系列AR-23改構肽,用來研究正電荷氨基酸殘基的數目和分布對抗菌肽選擇性毒性的影響。我們測定了改構肽在水溶液和不同膜模擬環(huán)境中的二級結構,評價了改構肽的抑菌活性和抗生物膜活性以及改構肽的溶血活性和對L929細胞的細胞毒性,并初步探索了改構肽破壞細胞膜的機制。結果顯示,三個天然抗菌肽均具有良好的抑菌活性,同時,具有較多正電荷氨基酸殘基的RV-23對細菌的選擇性毒性較高,具有最高的治療指數,三個抗菌肽均具有典型的α-螺旋結構,其中RV-23的α-螺旋含量最低,這可能與其真核細胞毒性低有關,同時RV-23的疏水性也較低,因為高疏水性和高α-螺旋含量可能與抗菌肽的高溶血活性相關,因此,RV-23對細菌的選擇性毒性高可能是由于其疏水性和α-螺旋性均較低。RV-23不僅對細菌的選擇性毒性較高,其對血液成分如紅細胞、血小板的影響也較小,對凝血纖溶系統(tǒng)的功能基本沒有影響。正電荷氨基酸殘基的位置對抗菌肽的選擇性毒性影響較大,用帶正電荷的賴氨酸殘基取代AR-23疏水面上第17位異亮氨酸殘基能明顯改變多肽的疏水性、兩親性、螺旋性以及其溶血活性,然而,在親水面上用帶正電荷的氨基酸殘基進行取代,對AR-23的物理性質和生物活性影響較小。在AR-23疏水面上進行取代能夠在保持其裂解細菌細胞膜活性的同時減少其對真核細胞膜的粘附和破壞。改構肽A8(第1、8和17位殘基均被帶正電荷的氨基酸殘基取代)對細菌的選擇性毒性最高,真核細胞毒性最低,同時A8還具有一定的抗生物膜能力。二、電荷對抗菌肽在酸性條件下膜裂解活性的影響及其增強基因轉染效率的作用研究。在這部分實驗中,我們通過將melittin和RV-23序列中帶正電荷的氨基酸殘基全部替換成帶負電荷的谷氨酸殘基來設計pH敏感肽,用于增強陽離子聚合物基因遞送載體的遞送效率,通過溶血實驗和鈣黃綠素釋放實驗,我們對比了谷氨酸殘基替換后的改構肽在中性和酸性pH條件下的膜裂解活性,檢測了帶負電荷的改構肽對陽離子遞送載體聚乙烯亞胺(PEI)/質粒DNA復合物物理特征的影響,同時檢測了改構肽對PEI/寡核苷酸(ODN)在細胞內運輸的影響,最后我們評價了改構肽增強PEI介導的基因轉染效率的能力及其細胞毒性。此外,我們還對AR-23帶正電荷的氨基酸殘基用谷氨酸殘基進行系統(tǒng)地替換,研究抗菌肽谷氨酸殘基數對其pH敏感性的影響,同樣的我們通過溶血實驗和鈣黃綠素釋放實驗檢測了多肽凈電荷數對其在酸性pH條件下膜裂解活性的影響,還評價了不同谷氨酸殘基數的多肽對聚賴氨酸(PLL)介導的基因轉染效率和對PLL/寡核苷酸(ODN)在細胞內運輸的影響。結果顯示,谷氨酸殘基替換后的抗菌肽在酸性pH條件下具有較高的α-螺旋率及較高的膜裂解活性,而在中性環(huán)境中的膜裂解能力顯著降低。谷氨酸殘基替換后的改構肽不影響PEI縮合質粒DNA的能力,而對PEI/DNA復合物的粒徑和zeta-電位有明顯的影響,透視電鏡顯示摻入改構肽的PEI/DNA復合物聚團、呈不規(guī)則的大顆粒。將改構肽摻入PEI/ODN復合物能明顯增強FITC-ODN釋放進入細胞質,同時能夠增強PEI介導的轉染效率,而且僅少量增加PEI的細胞毒性�？咕墓劝彼釟埢鶖祵ζ鋚H敏感性的影響較大。對AR-23而言,只有當谷氨酸殘基數多于兩個時,其在酸性pH條件下的膜裂解活性才較高,只有含3個谷氨酸殘基的改構肽增強PLL的轉染效率才較明顯,其增強PLL轉染效率的潛能高于常用的氯喹,并且產生的細胞毒性遠低于氯喹。綜上所述,一方面通過對天然抗菌肽進行正電荷氨基酸替換,我們獲得了對細菌選擇性毒性高而對真核細胞毒性較低的合成肽,這有利于抗菌肽的臨床應用。另一方面通過用谷氨酸殘基替換天然抗菌肽正電荷氨基酸殘基,我們獲得了在酸性條件下膜裂解活性較高的多肽,這類多肽可作為增強劑用于增強陽離子聚合物的轉染效率。本研究為推進抗菌肽的應用奠定了基礎。
[Abstract]:In addition , the antibacterial peptide can be used in cationic polymer - mediated transfection applications .

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R978

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