本文選題：人源化小鼠 + 重組人生長激素�。� 參考：《吉林大學》2017年博士論文

【摘要】：研究目的:種屬間的差異導致通過傳統(tǒng)動物模型無法準確預測人類生理、病理情況并有效評價藥物臨床效果。在免疫缺陷小鼠上共移植人胚胎胸腺和人胎肝造血干細胞建立的具有人免疫系統(tǒng)的人源化小鼠模型被國際公認為當前整體研究人類免疫學問題以及相關疾病的最有效工具之一。然而,由于小鼠分泌的某些造血免疫發(fā)育相關因子和人細胞無反應或反應弱,人源化小鼠中的人免疫系統(tǒng)組成和功能還不完善,需要進一步優(yōu)化。作為神經內分泌系統(tǒng)的重要一員,生長激素(growth hormone,GH)已被體外實驗與小鼠體內實驗證明同胸腺發(fā)育、骨髓中淋巴造血細胞分化都有密切聯(lián)系。有研究表明,小鼠生長激素(mouse growth hormone,mGH)與人體細胞的生長激素受體(growth hormone receptor,GHR)激活無交叉反應,這可能成為限制人源化小鼠中人免疫系統(tǒng)的重建和功能的潛在因素。因此,研究人生長激素對人源化小鼠中人造血免疫系統(tǒng)的影響及其作用機制,并據(jù)此優(yōu)化人源化小鼠模型的構建方案具有重要意義。本研究以期通過重組人生長激素(recombinant huamn growth hormone,rhGH)優(yōu)化人源化小鼠人免疫系統(tǒng)的重建。同時,借助人源化小鼠模型,探究rhGH對人胚胎造血干細胞(human hematopoietic stem cell,hHSC)及各造血免疫細胞亞群體內增殖分化的影響。研究方法:(1)體外建立造血干細胞擴增體系,利用BrdU試劑盒檢測并比較不同濃度rhGH單獨或聯(lián)合造血干細胞因子(stem cell factor,SCF)時對造血干細胞擴增效率的影響。(2)構建人源化小鼠模型:通過免疫磁珠分選方法分選出人胚胎肝臟內的CD34+造血干細胞并檢測純度。亞致死劑量照射免疫缺陷小鼠——NCG小鼠,進一步清除小鼠的造血免疫組織。將造血干細胞以尾靜脈注射方式移植到NCG小鼠體內。(3)在人源化小鼠構建第3周、6周、9周時檢測人源化小鼠體內的人造血免疫細胞水平。主要檢測人白細胞(whitebloodcell,wbc)、髓系細胞、t淋巴細胞、b淋巴細胞、nk細胞、樹突狀細胞、紅細胞占外周血總細胞及人免疫細胞比例。在人源化小鼠重建10周后處死小鼠,檢測小鼠外周血(peripheralblood,pb)、脾臟、骨髓(bonemarrow,bm)中上述細胞比例。同時,檢測小鼠外周血、脾臟、骨髓、胸腺中t淋巴細胞及其亞群比例:檢測輔助性t細胞(thelpcells,th)、細胞毒性t細胞(cytotoxictcells,tc)比例;靜息t細胞、效應t細胞;中樞記憶性t細胞(centralmemorytcells,tcm)、效應記憶性t細胞(effectormemorytcells,tem)、終末分化t細胞(terminaldifferentiationaltcells,ttd)比例;及胸腺新產生的輔助性t細胞比例;檢測小鼠外周血、脾臟及骨髓中分化發(fā)育各階段b淋巴細胞比例:b細胞祖細胞(pro-b)、b細胞前體細胞(pre-b)、未成熟b細胞(immature-b)、成熟b細胞(mature-b)比例;檢測骨髓中紅細胞及其發(fā)育各階段的亞群比例:較幼稚的大紅細胞、較成熟的小紅細胞;及根據(jù)cd71和cd235a表面標志物區(qū)分的原紅細胞、中幼紅細胞、晚幼紅細胞、網織紅細胞和成熟紅細胞紅細胞比例。(4)利用流式細胞術檢測經rhgh體外擴增的hhsc以及人源化小鼠骨髓內重建的hhsc中,具有持續(xù)多潛能性的hhsc比例變化。(5)利用連續(xù)移植hhsc構建人源化小鼠的方法驗證rhgh對造血干細胞持續(xù)多潛能性的影響。通過將人源化小鼠骨髓內重建的cd34+的hhscs作為移植物,移植到另一批免疫缺陷小鼠體內,構建人源化小鼠二次移植模型。評價rhgh處理對hhsc在人源化小鼠體內二次重建人免疫造血系統(tǒng)能力的影響。研究結果:(1)體外造血干細胞擴增中,rhgh組造血干細胞的擴增效率明顯弱于scf組。不同濃度的rhgh對造血干細胞的作用結果不同,低濃度(10ng/ml)組可促進造血干細胞增殖,中等濃度及高濃度rhgh未表現(xiàn)出促增殖作用,亦不表現(xiàn)抑制作用。低濃度rhgh協(xié)同scf可進一步提高造血干細胞的增殖效率。(2)在構建人源化小鼠后,rhgh組小鼠狀態(tài)恢復更快,骨髓he染色發(fā)現(xiàn)rhgh組造血組織結構恢復較快。在構建后第3周、第6周、第9周檢測到rhgh組外周血中表達cd45的白細胞比例明顯增加,約為對照組的2倍。各免疫細胞亞群細胞數(shù)增加,且在人白細胞中比例與PBS組無明顯差異。在構建第10周檢測脾臟及骨髓中結果與外周血中趨勢一致。(3)構建人源化小鼠第10周檢測小鼠脾臟、外周血、胸腺及骨髓中T細胞及其各亞群比例,rhGH組胸腺新產生的輔助性少于對照組,其余T細胞亞群比例與PBS組均無差別。(4)構建人源化小鼠第10周檢測小鼠脾臟、外周血及骨髓中B細胞及其發(fā)育各階段細胞亞群的比例,rhGH組人B細胞重建水平更高。骨髓中Pro-B細胞比例高于對照組,其余分化各階段細胞無明顯差異。外周血及脾臟中,rh GH提高了Pro-B細胞和Pre-B細胞在較幼稚的細胞的比例。(5)構建人源化小鼠第10周時檢測骨髓中人紅細胞及其發(fā)育各階段細胞亞群比例:rhGH組骨髓中人紅細胞重建水平更高,較幼稚的大紅細胞比例增加,且原紅細胞、中幼紅細胞和晚幼紅細胞比例均高于對照組,而網織紅細胞和成熟紅細胞比例在兩組間無差異。外周血中未檢測到人紅細胞。(6)rhGH體外促進造血干細胞增殖時,其中具有持續(xù)多潛能性的hHSC比例與對照組相比未發(fā)生變化,人源化小鼠骨髓內造血干細胞持續(xù)多潛能性檢測得到相似結果。二次移植hHSC的人源化小鼠人免疫系統(tǒng)重建在兩組均可實現(xiàn)。研究結論:rhGH可促進人胚胎造血干細胞增殖及人源化小鼠體內造血免疫系統(tǒng)的重建,并且不影響人胚胎造血干細胞的持續(xù)多潛能性,最終優(yōu)化人源化小鼠模型:(1)rhGH可促進人源化小鼠骨髓、脾臟及外周血中人白細胞(主要為B淋巴細胞)重建水平,尤其增加較幼稚的B細胞祖細胞和B細胞前體細胞的比例。(2)rhGH可促進人源化小鼠骨髓內人紅細胞的重建,尤其是較幼稚的原紅細胞、中幼紅細胞及晚幼紅細胞的重建。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R-332;R392

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本文編號：1751844