本文選題：血紅素氧化酶-1 + 核因子E2相關(guān)因子2�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:子癇前期是一種妊娠特發(fā)性疾病,目前約有4%的孕婦患有子癇前期,嚴(yán)重威脅孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒的健康,導(dǎo)致多種發(fā)病率包括早產(chǎn)率的升高。子癇前期的高危因素包括肥胖、高齡產(chǎn)婦、孕婦糖尿病、種族、抗磷脂抗體綜合征/易栓癥、家族子癇前期病史等,其病因?qū)W一直是圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn),但其明確病因目前尚不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)子癇前期的發(fā)病與氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)等多種病理生理反應(yīng)有關(guān),而氧化應(yīng)激是眾多影響因素中最重要的一項(xiàng)。血紅素氧化酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)屬于血紅素氧化酶的一個(gè)亞型,是一種誘導(dǎo)酶,它的常見功能是在游離的亞鐵血紅素轉(zhuǎn)變成膽紅素時(shí)對限速步驟起催化作用,將血紅素轉(zhuǎn)變?yōu)槟懢G素,膽綠素是在轉(zhuǎn)換成膽紅素過程最后一步中膽綠素還原酶作用的底物。血紅素氧化酶有不同的生物學(xué)功能,HO-1能夠調(diào)節(jié)并參與機(jī)體抗炎、抗凋亡及抗氧化應(yīng)激作用,并且有助于維持孕期子宮血管的穩(wěn)定性并參與孕期胎盤的形成,與子癇前期的發(fā)病關(guān)系密切。近期學(xué)者們關(guān)于HO-1在子癇前期病人血清或胎盤組織中的表達(dá)水平及作用機(jī)制等方面的研究較多,但是結(jié)果及觀點(diǎn)并不統(tǒng)一。核因子 E2 相關(guān)因子 2(Nuclear factor erythroid 2-related factor-2,Nrf2)屬于CNC-bZIP(cap'n'collar subfamily of basic leucine-zipper),也就是 CNC 亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族,可以被機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)激活。早前有研究證實(shí)Nrf2在氧化應(yīng)激過程中參與調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的保護(hù)性基因,保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的侵害,并且Nrf2在保護(hù)機(jī)體抵御致癌物質(zhì)、親電子試劑及活性氧等毒性侵害的過程中扮演重要角色。在機(jī)體多種氧化應(yīng)激反應(yīng)中,Nrf2可以激活機(jī)體保護(hù)基因包括HO-1基因,而在子癇前期病人的氧化應(yīng)激反應(yīng)中,二者是否共同參與疾病的病理生理過程并且是否存在信號通路或者關(guān)聯(lián)作用,并未得到證實(shí)。我們推斷Nrf2和HO-1在子癇前期的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起到重要的作用�；蛟SNrf2作為HO-1重要的上游調(diào)節(jié)因子,在子癇前期發(fā)病的病理生理過程中也起到對HO-1的調(diào)節(jié)作用,二者作為一個(gè)信號通路參與了子癇前期的發(fā)病。子癇前期的另外一個(gè)臨床特點(diǎn)是在治療方面:目前沒有預(yù)防和治療子癇前期的有效措施,只有終止妊娠,胎盤娩出后,子癇前期的癥狀才可以得到抑制和改善,所以胎盤因素一直被當(dāng)作參與子癇前期發(fā)病的重要原因�，F(xiàn)在盛行的假設(shè)是子癇前期是由異常的滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵入母體子宮螺旋動脈不足即胎盤淺著床導(dǎo)致的子宮胎盤單位血循環(huán)降低和胎盤缺血導(dǎo)致的。實(shí)際上,子癇前期病人與正常妊娠孕婦相比,的確子宮動脈管徑更細(xì),阻力更大。但目前胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制仍不清楚,也沒有針對此方面的靶向治療。因此,從胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力方面入手,如果探尋到可以影響胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮螺旋動脈的因素,除了對子癇前期病因?qū)W方面有重要意義外,對于子癇前期的靶向治療也具有較大意義。基于上述基礎(chǔ),我們?nèi)绻C實(shí)Nrf2作為上游因子調(diào)控HO-1參與子癇前期發(fā)病的病理生理過程,對于后續(xù)HO-1在子癇前期病人的發(fā)病及治療中的研究將具有重要意義。若能進(jìn)一步證實(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)水平的改變能夠?qū)ψ甜B(yǎng)細(xì)胞的侵襲性造成影響,對于子癇前期病因?qū)W和靶向治療等方面將具有重要價(jià)值。第一部分子癇前期病人胎盤組織中HO-1和Nrf2升高的協(xié)同作用目的:檢測重度子癇前期病人胎盤組織中HO-1和Nrf2的表達(dá)水平差異,并且驗(yàn)證HO-1和Nrf2在胎盤組織中的表達(dá)是否有相關(guān)性,探討HO-1和Nrf2在子癇前期發(fā)病中的作用,并且通過HTR-8/SVneo細(xì)胞系培養(yǎng),進(jìn)一步探討Nrf2對HO-1的調(diào)控效應(yīng),驗(yàn)證在子癇前期發(fā)病中Nrf2是否為HO-1的上游調(diào)控因子。方法:1.共選取60例住院分娩孕婦作為研究對象,其中30例重度子癇前期患者作為研究組,30例健康足月妊娠孕婦作為對照組。2.用ELISA方法檢測兩組孕婦血清中HO-1蛋白的表達(dá)水平。3.采用Western blot方法檢測兩組孕婦胎盤組織中HO-1蛋白、Nrf2蛋白表達(dá)水平。4.用real-time PCR方法檢測兩組孕婦胎盤組織中HO-1 mRNA的表達(dá)水平。5.培養(yǎng)HTR-8/SVneo細(xì)胞系,免疫熒光定位細(xì)胞中HO-1、Nrf2蛋白的表達(dá)。6.采用 Nrf2 誘導(dǎo)因子 tert-butylhydroquinone(tBHQ)誘導(dǎo) HTR-8/SVneo 細(xì)胞8小時(shí)后,分別檢測細(xì)胞中Nrf2蛋白和HO-1 mRNA、HO-1蛋白的表達(dá)水平變化情況。結(jié)果:1.在重度子癇前期組,FGR的發(fā)生率為16.7%,其中20%的病例發(fā)生了 HELLP綜合征,1例患者(3.3%)孕期發(fā)生胎兒宮內(nèi)死亡。其中25例病人因重度高血壓(收縮壓160≥mmHg和/或舒張壓11OmmHg)接受降壓治療。另外,30例病人均接受硫酸鎂解痙治療,23例病人因?yàn)榻K止妊娠孕周34進(jìn)行地塞米松促胎肺成熟治療。2.與正常妊娠組相比,重度子癇前期組血清HO-1蛋白水平明顯降低(n = 30,P0.01)。3.重度子癇前期組胎盤組織HO-1蛋白、HO-1 mRNA水平較正常妊娠組升高(n = 30,P0.01;n = 30,P0.05)。4.重度子癇前期組胎盤組織Nrf2蛋白的表達(dá)水平較正常妊娠孕婦增高(n =30,P0.01)。5.采用Pearson's相關(guān)性檢驗(yàn)檢測兩組孕婦胎盤組織中HO-1蛋白和Nrf2蛋白水平的相關(guān)性,結(jié)果顯示HO-1蛋白和Nrf2蛋白水平成正相關(guān)(r = 0.503,P0.01)。采用Spearman等級相關(guān)性分析檢測兩組孕婦胎盤組織中Nrf2蛋白與HO-1 mRNA的相關(guān)性,同樣發(fā)現(xiàn)Nrf2蛋白與HO-1 mRNA成正相關(guān)性(r = 0.488,P0.01)。6.免疫熒光定位顯示HTR-8/SVneo細(xì)胞核與細(xì)胞漿中均可見Nrf2蛋白表達(dá),HO-1蛋白主要表達(dá)于HTR-8/SVneo細(xì)胞的胞漿。7.在HTR-8/SVneo細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Nrf2誘導(dǎo)物tBHQ刺激細(xì)胞8小時(shí)后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)量較對照細(xì)胞升高(n = 6,P0.05)。并且接受tBHQ孵育的HTR-8/SVneo細(xì)胞中HO-1 mRNA的表達(dá)水平也較對照細(xì)胞升高(n = 6,P0.01)。結(jié)論:1.與正常妊娠婦女相比較,重度子癇前期患者血清中HO-1水平降低。而重度子癇前期患者胎盤組織中HO-1蛋白和mRNA的表達(dá)均增高。胎盤和血清中H0-1表達(dá)水平不一致的原因可能是HO-1可以由機(jī)體多個(gè)器官合成,而妊娠期胎盤合成的HO-1并不是血清中HO-1的主要來源。2.重度子癇前期患者胎盤組織中HO-1和Nrf2水平同時(shí)增高,子癇前期孕婦可能通過胎盤組織中HO-1和Nrf2的高表達(dá)來保護(hù)子癇前期發(fā)病過程中氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷。3.在子癇前期發(fā)病的病理生理過程中,胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中Nrf2可能作為HO-1的上游調(diào)控因子對HO-1的表達(dá)進(jìn)行正向調(diào)節(jié),激活HO-1,增加胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HO-1的表達(dá)量。第二部分HO-1對氧化應(yīng)激環(huán)境下滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的影響目的:我們第一部分的研究提示:Nrf2在子癇前期發(fā)病中對HO-1進(jìn)行正向調(diào)節(jié),共同參與子癇前期發(fā)病的病理生理過程。而HO-1表達(dá)量的改變在氧化應(yīng)激狀態(tài)下是否對胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力造成影響,尚不明確。為進(jìn)一步研究HO-1表達(dá)量的改變對胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,擬建立HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,然后分別抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞中HO-1蛋白的表達(dá),來探討HTR-8/SVneo細(xì)胞在氧化應(yīng)激環(huán)境下HO-1表達(dá)量的改變是否對HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲能力造成影響。方法:1.培養(yǎng)HTR-8/SVneo細(xì)胞系,用100umol/lH202孵育12小時(shí)建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。2.將細(xì)胞模型分為三組:正常對照組、Znpp誘導(dǎo)組和Hemin誘導(dǎo)組,分別在三組細(xì)胞中加入相同體積的生理鹽水、HO-1抑制劑Znpp和HO-1誘導(dǎo)劑Hemin,然后放置于37℃、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)備用。3.通過免疫熒光定位觀察HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中HO-1蛋白的表達(dá)及定位。4.采用Western blot方法分別檢測對照組、Znpp誘導(dǎo)組和Hemin誘導(dǎo)組HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中HO-1蛋白表達(dá)水平的變化。5.通過Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察在HO-1抑制劑Znpp和誘導(dǎo)劑Hemin作用下HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型侵襲能力的改變。結(jié)果:1.在HTR-8/SVneo細(xì)胞系氧化應(yīng)激模型中HO-1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿。2.在HO-1抑制劑Znpp的作用下,HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中HO-1蛋白的表達(dá)量較對照組降低(n = 6,P0.05);在HO-1誘導(dǎo)劑Hemin的孵育下,HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中HO-1蛋白的表達(dá)量較對照組升高(n = 6,P0.05)。3.HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型在HO-1表達(dá)水平降低時(shí)其侵襲能力降低(n = 6,P 0.05);反之,在HO-1表達(dá)水平增高的情況下其侵襲能力有所提高(n=6,P0.05)。結(jié)論:1.HO-1抑制劑Znpp能夠有效抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中HO-1的表達(dá)水平;同樣,HO-1誘導(dǎo)劑Hemin能夠有效誘導(dǎo)HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中HO-1的表達(dá)水平。2.在氧化應(yīng)激環(huán)境中提高滋養(yǎng)細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)水平能夠增加其侵襲能力,而降低HO-1蛋白表達(dá)水平則降低滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力,因此可嘗試通過調(diào)控胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中HO-1的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)對子癇前期的靶向治療。
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本文編號：1751675