發(fā)布時(shí)間：2018-04-12 16:56

  本文選題：HSC-T6細(xì)胞 + α-酮戊二酸二甲酯　； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：肝纖維化是肝組織的損傷修復(fù)反應(yīng)過程,是以Ⅰ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)在肝組織的的凈沉積。肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理變化特征,是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)病理階段。而肝硬化治療困難、死亡率高。因此,調(diào)控肝纖維化對改善慢性肝病預(yù)后至關(guān)重要,并且已成為研究的熱點(diǎn)。在肝損傷時(shí),活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是造成細(xì)胞外基質(zhì)沉積的主要細(xì)胞。在正常肝臟中,HSC處于靜止?fàn)顟B(tài),存在于Disse間隙。靜止?fàn)顟B(tài)的HSC富含大量脂滴,其主要由脂肪酸、甘油三酯和維生素A等組成。在肝損傷發(fā)生時(shí),HSC在旁分泌信號的作用下發(fā)生活化,細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失,轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞表型;獲得收縮、遷移、促纖維化等新特性;并開始表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA),分泌以Ⅰ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)并造成細(xì)胞外基質(zhì)的凈沉積�；罨腍SC是肝纖維化發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞。因此,如何抑制HSC的活化成為治療肝纖維化研究的重要方向。自噬(通常所說的自噬泛指巨自噬,本文中的自噬亦均指巨自噬)是真核細(xì)胞在進(jìn)化過程中的一種高度保守的代謝機(jī)制。自噬發(fā)生時(shí),細(xì)胞通過雙層膜包裹細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器、脂滴等成分形成自噬體,隨后在自噬體與溶酶體融合之后包裹的內(nèi)容物被溶酶體降解,營養(yǎng)成分和所產(chǎn)生的能量則重新被細(xì)胞利用。自噬作為一種分解代謝過程對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成、分泌均是耗能過程,需要持續(xù)的的能量供應(yīng)。研究證實(shí),HSC活化時(shí)自噬將細(xì)胞內(nèi)的脂滴吞噬、分解并釋放脂肪酸,后者經(jīng)β氧化作用生成ATP;此過程是HSC活化主要的能量來源;阻斷自噬可抑制HSC的活化。但常用的自噬抑制劑因長期體內(nèi)應(yīng)用時(shí)常導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng),而在治療肝纖維化的應(yīng)用中受到限制。因此,如何有效且安全地抑制HSC自噬成為抑制HSC活化研究的重要課題。αα-酮戊二酸是細(xì)胞內(nèi)的一種天然成分,主要參與營養(yǎng)物質(zhì)的的代謝過程,對其調(diào)控的安全性較高。近年多項(xiàng)研究證實(shí)改變細(xì)胞內(nèi)的α-酮戊二酸水平可調(diào)控細(xì)胞的自噬,但可能因?yàn)檫@些研究涉及的細(xì)胞類型各異,目前尚無一致的研究的結(jié)論。并且在本實(shí)驗(yàn)之前,尚無通過改變α-酮戊二酸水平調(diào)控HSC自噬或活化的研究。α-酮戊二酸二甲酯(dimethyl α-ketoglutarate,DMKG)是α-酮戊二酸水平調(diào)控研究的常用試劑。相對于α-酮戊二酸本身,DMKG更易通過細(xì)胞膜。DMKG進(jìn)入細(xì)胞后將迅速被細(xì)胞內(nèi)的酯酶分解并生成α-酮戊二酸,從而顯著提高細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸水平。本實(shí)驗(yàn)研究了 DMKG對HSC活化及肝纖維化的影響,并驗(yàn)證該影響是否與自噬有關(guān)聯(lián),另外我們也對DMKG影響HSC自噬的可能機(jī)制進(jìn)行了探索。第一部分:體外實(shí)驗(yàn)中DMKG對HSC的活化的影響目的:體外實(shí)驗(yàn)中,利用MTT法檢測梯度濃度的DMKG對肝細(xì)胞系、活化的HSC細(xì)胞系生存率的影響,篩選出不影響兩種細(xì)胞系生存率的DMKG安全濃度范圍�；罨硇偷腍SC細(xì)胞系在添加上述安全濃度的DMKG培養(yǎng)后,利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法及western-blot法檢測HSC活化指標(biāo)的表達(dá)變化,評估DMKG對HSC活化的影響。方法:1.采用肝星狀細(xì)胞系HSC-T6和肝細(xì)胞系BRL-3A進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HSC-T6為永生活化表型。兩者均用高糖DMEM+10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)。2.向HSC-T6和BRL-3A細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入梯度濃度的DMKG(0-32mM),培養(yǎng)24小時(shí)后,利用MTT法檢測細(xì)胞生存率,并進(jìn)行定量分析。3.用上述方法探索得到不影響兩種細(xì)胞生存率的DMKG濃度范圍,向HSC-T6細(xì)胞系培養(yǎng)基中加入上述濃度范圍內(nèi)的DMKG,并設(shè)置空白對照組,培養(yǎng)結(jié)束后,利用Trizol提取細(xì)胞總RNA,利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測HSC活化指標(biāo)Ⅰ型膠原、α-SMA的mRNA水平,并進(jìn)行相對定量分析。4.向HSC-T6細(xì)胞系培養(yǎng)基中加入同上一步相同濃度的DMKG,并設(shè)置空白對照組,培養(yǎng)結(jié)束后,利用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,利用western-blot法檢測HSC活化指標(biāo)Ⅰ型膠原、α-SMA的蛋白表達(dá)量,并進(jìn)行相對定量分析。結(jié)果:1.DMKG濃度在1-18mM范圍內(nèi)時(shí),對肝細(xì)胞生存率無顯著影響。DMKG濃度在20-32mM范圍內(nèi)時(shí),對肝細(xì)胞生存率產(chǎn)生濃度依賴性抑制作用。2.DMKG濃度在1-16mM范圍內(nèi)時(shí),對HSC的生存率無顯著影響。DMKG濃度在18-32mM范圍內(nèi)時(shí),對HSC細(xì)胞生存率產(chǎn)生濃度依賴性抑制作用。3.DMKG濃度在18-32mM范圍內(nèi)時(shí),對于同樣濃度的DMKG,HSC的生存率顯著低于肝細(xì)胞的生存率。4.4mM濃度的DMKG能顯著下調(diào)HSC細(xì)胞α-SMA的mRNA水平;1mM及4mM濃度的DMKG均能顯著下調(diào)HSC細(xì)胞Ⅰ型膠原的mRNA水平。5.1mM、4mM濃度的DMKG均可顯著抑制HSC細(xì)胞α-SMA和Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)。結(jié)論:1.低濃度(≤16mM)的DMKG短時(shí)間內(nèi)并不影響肝細(xì)胞及HSC的生存率,且肝細(xì)胞比HSC對高濃度(≥18mM)DMKG的生存率抑制耐受性更好。2.體外實(shí)驗(yàn)中,安全濃度范圍內(nèi)低濃度(1mM、4mM)的DMKG即可顯著抑制HSC的活化。第二部分:DMKG對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的影響目的:建立CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型,在造模期間腹腔注射DMKG,觀察DMKG對肝纖維化程度及肝功能的影響。方法:1.動(dòng)物模型:6周齡成年雄性Wistar大鼠,將50%CCl4橄欖油溶液1ml/kg(即CCl4,0.5ml/kg)每周兩次(周二、周四)大鼠腹腔注射,共9周。2.藥物干預(yù)及分組:20只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、單純DMKG腹腔注射組、CCl4模型組、CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組。每組5只。模型組造模方法如上所述。CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組在造模之日起,每周2次(周三、周五)DMKG 200mg/kg(溶于2ml PBS)腹腔注射。單純DMKG注射組在給與以上劑量DMKG注射的同時(shí),給與單純橄欖油0.5ml/kg腹腔注射。正常對照組,只給與相同劑量的橄欖油和PBS腹腔注射。滿9周時(shí),所有大鼠全部處死并留取肝組織及血清標(biāo)本。3.肝臟組織化學(xué)染色:新鮮大鼠肝組織福爾馬林溶液固定、石蠟包埋、并制成5μm厚石蠟切片。利用Masson復(fù)合染液、亮綠染液對石蠟切片進(jìn)行Masson染色,顯微鏡下可見膠原纖維被染成綠色。利用苦味酸天狼星紅染液染液對石蠟切片進(jìn)行天狼星紅染色,染色后的組織切片在偏振光顯微鏡暗場下可見Ⅰ型膠原纖維緊密排列,顯示很強(qiáng)的雙折光性,為亮紅-亮橘紅色纖維。天狼星紅染色陽性面積計(jì)算公式:天狼星紅陽性面積/(照片面積—照片中管腔面積)×100%。4.肝組織羥脯氨酸含量檢測:利用比色法測定肝組織羥脯氨酸的含量,可以反映肝纖維化程度。肝組織研磨制成勻漿,用濃鹽酸進(jìn)行酸水解。水解后的樣品用氫氧化鈉中和后,加入ehrlich試劑顯色,測量570nm波長吸光度值。根據(jù)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并以此計(jì)算各樣本的羥脯氨酸含量。5.肝功能檢測:ALT、AST可反映肝細(xì)胞的損傷程度。利用相應(yīng)成品試劑盒進(jìn)行檢測,操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果:1.Masson染色和天狼猩紅染色均顯示CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組的膠原纖維面積較CCl4模型組明顯減少。定量分析顯示,天狼猩紅染色陽性面積減少了 44%。2.CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組的肝組織羥脯氨酸含量較CCl4模型組顯著降低。3.ALT與AST化驗(yàn)結(jié)果顯示,正常對照組與單純DMKG腹腔注射組之間無顯著差別、CCl4模型組與CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組之間無顯著差別。結(jié)論:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,DMKG可減輕CCl4肝纖維化模型的肝纖維化程度。2.體內(nèi)應(yīng)用時(shí),DMKG并不誘發(fā)或加重肝細(xì)胞損傷。第三部分:DMKG影響HSC活化及肝纖維化的機(jī)制研究目的:本部分實(shí)驗(yàn)將探討DMKG影響HSC活化的機(jī)制是否自噬有關(guān)。若有關(guān)聯(lián),本部分還將對DMKG影響HSC自噬的可能機(jī)制進(jìn)行探索。方法:1.肝組織免疫熒光染色(雙標(biāo)):α-SMA是HSC活化的標(biāo)記物,而在肝細(xì)胞并無表達(dá)。LC3B和Beclin-1均為反映自噬強(qiáng)度的指標(biāo),與自噬呈正相關(guān)。5μm厚的石蠟切片經(jīng)脫蠟處理后,煮沸行抗原修復(fù)。切片經(jīng)相應(yīng)的一抗(小鼠源抗α-SMA、兔源抗LC3B或Beclin-1)孵育過夜后,再用對應(yīng)的二抗(α-SMA對應(yīng)紅色熒光二抗、LC3B和Beclin-1對應(yīng)綠色熒光二抗)孵育。熒光顯微鏡下觀察并拍照。利用軟件對紅綠熒光強(qiáng)度、共定位關(guān)系進(jìn)行分析。2.透射電子顯微鏡觀察自噬體是自噬檢測的"金標(biāo)準(zhǔn)"。為明確DMKG對HSC自噬的影響,HSC-T6培養(yǎng)基內(nèi)加入DMKG培養(yǎng)后,對細(xì)胞進(jìn)行固定并超薄切片,透射電子顯微鏡觀察自噬體并進(jìn)行定量分析。3.3MA是經(jīng)典的自噬抑制劑。HSC-T6培養(yǎng)基內(nèi)分別加入DMKG、3MA培養(yǎng)后,提取細(xì)胞總蛋白。Western-blot檢測HSC活化指標(biāo)α-SMA、Ⅰ型膠原以及自噬指標(biāo)LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表達(dá)。通過對比DMKG與3MA對HSC自噬及活化的影響,明確自噬在DMKG影響HSC活化中的作用。4.HSC-T6培養(yǎng)基內(nèi)加入DMKG培養(yǎng)后,對細(xì)胞行油紅染色以顯示細(xì)胞內(nèi)的脂滴。對脂滴占細(xì)胞的面積進(jìn)行定量分析。5.HSC-T6培養(yǎng)基內(nèi)加入DMKG培養(yǎng)后,利用ATP測定試劑盒對HSC細(xì)胞內(nèi)ATP水平進(jìn)行測定,操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。6.激活mTORC1可抑制自噬。S6核糖體蛋白作為mTORC1的下游底物,其磷酸化水平可較準(zhǔn)確地反映mTORC1的活性。向HSC-T6培養(yǎng)基加入DMKG培養(yǎng)后,western-blot檢測細(xì)胞S6蛋白總含量、磷酸化S6蛋白的含量。計(jì)算S6蛋白的磷酸化水平,以評估DMKG對HSC細(xì)胞mTORC1活性的影響。7.DMKG可增高細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸的含量,而α-酮戊二酸可通過代謝途徑轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A。有文獻(xiàn)提示乙酰輔酶A可能增強(qiáng)組蛋白乙酰化酶EP300的活性,而另外的文獻(xiàn)則提示EP300可通過使部分自噬相關(guān)蛋白發(fā)生乙�；种谱允�。硫辛酸是DMKG之外的另外一種可提高細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A水平的物質(zhì),而c646是乙酰輔酶A對EP300作用的特異性阻斷劑。我們通過向HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加DMKG、硫辛酸以及c646培養(yǎng)后,western-blot檢測自噬指標(biāo)LC3B、Beclin-1以及HSC活化指標(biāo)α-SMA和Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)水平。以明確DMKG抑制HSC自噬的機(jī)制,并進(jìn)一步驗(yàn)證DMKG通過抑制HSC自噬而抑制HSC活化的結(jié)論。結(jié)果:1.肝組織免疫熒光(雙標(biāo))染色顯示,自噬指標(biāo)的熒光強(qiáng)度和HSC活化指標(biāo)的熒光強(qiáng)度在肝纖維化模型組均顯著增高,經(jīng)DMKG干預(yù)后兩者均顯著下降。并且自噬指標(biāo)和HSC活化指標(biāo)存在顯著的共定位關(guān)系。說明肝組織中HSC的活化與HSC自噬水平存在相關(guān)性,且均可被DMKG抑制。2.透射電鏡觀察結(jié)果顯示,對照組HSC細(xì)胞內(nèi)可見大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。DMKG處理后,HSC細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量顯著下降,即DMKG可抑制HSC的自噬。3.HSC細(xì)胞DMKG處理組和3MA處理組,自噬指標(biāo)均出現(xiàn)顯著下降。更重要的是,HSC活化指標(biāo)的下降趨勢與自噬指標(biāo)的下降趨勢一致。說明DMKG通過抑制自噬而抑制HSC的活化。4.之前有研究證實(shí)自噬促進(jìn)HSC細(xì)胞內(nèi)脂滴的丟失并將其分解生成ATP,以促進(jìn)HSC的活化。本實(shí)驗(yàn)油紅染色及ATP測定證實(shí),DMKG可阻斷HSC脂滴的丟失并能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP水平。5.DMKG對S6核糖體蛋白的磷酸化水平無顯著影響,即DMKG并不影響HSC的mTORC1活性。該結(jié)果說明DMKG抑制HSC自噬的機(jī)制為非mTORC1依賴的途徑。6.DMKG和硫辛酸均是乙酰輔酶A的供體,結(jié)果顯示HSC的自噬既能被DMKG抑制也能被硫辛酸抑制;c646是乙酰輔酶A與EP300作用的特異性抑制劑,結(jié)果顯示c646能逆轉(zhuǎn)DMKG和硫辛酸對HSC自噬的抑制作用。該結(jié)果說明DMKG通過乙酰輔酶A-EP300途徑抑制了 HSC的自噬。另外,c646逆轉(zhuǎn)DMKG、硫辛酸對HSC自噬抑制作用的同時(shí),兩者對HSC活化的抑制也被逆轉(zhuǎn),這進(jìn)一步說明DMKG通過抑制HSC自噬進(jìn)而抑制其活化。結(jié)論:1.DMKG通過抑制HSC的自噬抑制了 HSC的活化和肝纖維化。2.DMKG通過乙酰輔酶A-EP300途徑抑制了 HSC的自噬。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2

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本文編號：1740620