本文選題：蛋白水解 + 核磷酸酶　； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：肌肉萎縮是多種疾病的常見并發(fā)癥;慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)及與其相關(guān)的炎性細(xì)胞因子刺激蛋白質(zhì)能量消耗(protein energy wasting,PEW),這種復(fù)雜的過程表現(xiàn)為肌肉質(zhì)量的持續(xù)丟失。而導(dǎo)致肌肉損失是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程,主要是加速蛋白質(zhì)的降解實(shí)現(xiàn)的,然而這些蛋白質(zhì)水解過程中的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本課題主要研究核內(nèi)小分子磷酸酶SCP4/CTDSPL2(the small C-terminal domain phosphatase 4/the C-terminal domain small phosphatase like 2)通過調(diào)節(jié)Fox O1、3信號通路影響肌肉蛋白質(zhì)代謝;在CKD時(shí)由于NF-κB被激活而刺激SCP4表達(dá)增加,從而誘導(dǎo)肌肉蛋白降解。第一部分SCP4在肌肉蛋白代謝中的作用機(jī)制研究目的:旨在研究核磷酸酶SCP4/CTDSPL2如何通過調(diào)控Fox O轉(zhuǎn)錄因子影響肌肉蛋白質(zhì)的代謝,為臨床防治肌肉萎縮提供新的治療靶點(diǎn)。方法:采用細(xì)胞電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)使成肌細(xì)胞C2C12的SCP4基因抑制或過表達(dá)。過表達(dá)及對照組分別轉(zhuǎn)染GFP-SCP4和GFP,然后分別加入蛋白酶體和溶酶體抑制劑、IGF-1和BMP2處理細(xì)胞;在基因抑制組分別轉(zhuǎn)染SCP4-si RNA(si SCP4)和scrambled(si CTL)。采用同位素檢測技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的分解和合成;PCR微陣列分析SCP4過表達(dá)時(shí)與骨骼肌代謝、功能及疾病相關(guān)的基因表達(dá)變化;磷酸化蛋白微陣列檢測在細(xì)胞SCP4基因抑制后多種蛋白磷酸化水平的變化。采用western-blot檢測各組Akt、Fox O1、Fox O3a的蛋白表達(dá)及SCP4的轉(zhuǎn)染效率;Real-time PCR檢測各組Atrogin-1、Mu RF-1、MUSA1、Myostatin的m RNA表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞Fox O1出入細(xì)胞核的變化。采用電轉(zhuǎn)染技術(shù)使局部肌肉SCP4過表達(dá)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),免疫熒光染色觀察肌纖維橫截面積。結(jié)果:1)在骨骼肌細(xì)胞SCP4調(diào)控Fox Os和Smads信號通路;2)SCP4過表達(dá)促進(jìn)成肌細(xì)胞蛋白水解;3)SCP4過表達(dá)促進(jìn)肌肉損傷基因Atrogin-1、Mu RF-1、MUSA1和Myostatin的表達(dá);4)過表達(dá)SCP4使Fox O1、Fox O3a去磷酸化增加,抑制其出核;5)在正常小鼠中過表達(dá)SCP4也足以引起肌纖維萎縮。結(jié)論:SCP4通過調(diào)控Fox O1、Fox O3a的出入核,增加其轉(zhuǎn)錄活性,從而促進(jìn)損傷因子的表達(dá),誘導(dǎo)蛋白質(zhì)水解,肌肉萎縮。即使磷酸化Akt發(fā)生變化,過表達(dá)SCP4也能使Fox O1留在細(xì)胞核內(nèi),表明SCP4的是一種新的FOx O轉(zhuǎn)錄因子和蛋白水解信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子,可能為預(yù)防肌肉萎縮提供治療的新靶點(diǎn)。第二部分抑制SCP4基因可防止慢性腎臟病誘導(dǎo)的肌肉萎縮目的:旨在探討抑制SCP4基因在饑餓及慢性腎臟病誘導(dǎo)的肌肉萎縮中的保護(hù)作用。方法:使用電轉(zhuǎn)染技術(shù)使C2C12細(xì)胞SCP4基因敲抑,建立饑餓模型,轉(zhuǎn)染scrambled組(si CTL)、轉(zhuǎn)染scrambled+無血清培養(yǎng)(si CTL-SF)組、轉(zhuǎn)染SCP4-si RNA(si SCP4)組、轉(zhuǎn)染SCP4-si RNA+無血清培養(yǎng)組(si SCP4-SF),同位素法檢測蛋白降解率;建立CKD小鼠模型,采用免疫組化及western-blot檢測其骨骼肌以及健康成人和CKD患者腹直肌SCP4的蛋白表達(dá);采用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)使CKD小鼠局部肌肉SCP4基因敲抑,分為4組,假手術(shù)+轉(zhuǎn)染scrambled組(Sham+si CTL)、CKD+轉(zhuǎn)染scrambled組(CKD+si CTL)、假手術(shù)+轉(zhuǎn)染si SCP4組(Sham+si SCP4)、CKD+轉(zhuǎn)染SCP4組(CKD+si SCP4),肌纖維的橫截面積用免疫熒光染色觀察;western-blot檢測各組Akt、Fox O1、Fox O3a的蛋白表達(dá);Real-time PCR檢測各組Atrogin-1、Mu RF-1、MUSA1、Myostatin的m RNA表達(dá)。CKD相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6,IFN-γ、LPS及其混合物和QNZ(NF-κB抑制劑)作用于C2C12細(xì)胞,檢測細(xì)胞SCP4 m RNA和蛋白水平的變化;采用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Ch IP assay)來檢測NF-κB(p65)蛋白是否與SCP 4基因啟動(dòng)子序列相關(guān)。結(jié)果:1)SCP4基因敲抑可以降低饑餓誘導(dǎo)的蛋白降解率,抑制Fox O1/3a的轉(zhuǎn)錄活性,降低肌肉損傷因子的表達(dá);2)慢性腎臟病時(shí)肌肉中核磷酸酶SCP4表達(dá)增加,抑制SCP4基因可以防止CKD小鼠的肌肉萎縮;3)CKD相關(guān)炎性因子可以刺激肌細(xì)胞SCP4表達(dá)增加;轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(p65)蛋白與SCP4基因啟動(dòng)子序列相關(guān);QNZ處理C2C12細(xì)胞后,幾乎完全阻斷由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的SCP4表達(dá)的增加。結(jié)論:CKD時(shí)NF-κB被激活從而介導(dǎo)SCP4的表達(dá)增加,刺激肌肉蛋白水解;抑制SCP4的表達(dá)可以預(yù)防CKD及饑餓誘導(dǎo)的肌肉萎縮。這一結(jié)論可能為臨床防治CKD及其他代謝性疾病導(dǎo)致的肌肉萎縮提供新的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:鑲岃倝钀庣緝鏄縐嶇柧鐥呯殑甯歌騫跺彂鐥，

本文編號：1738049