本文選題：eIF6　切入點：增生性瘢痕　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：纖維化疾病是全球發(fā)病率與死亡率的主要原因,它改變組織及器官的正常結(jié)構(gòu),從而擾亂正常的功能。纖維化疾病能夠影響幾乎所有的器官,并與各種疾病及損傷相關(guān)聯(lián)。纖維化疾病常見于肝臟、肺臟、心臟、腎臟以及皮膚,是全球重大的疾病負擔(dān)。燒傷常常導(dǎo)致增生性瘢痕,排名全球纖維化疾病負擔(dān)的第15位。大多數(shù)器官纖維化的主要特征包括肌成纖維細胞的增多、分化及持續(xù)存在、膠原沉積與降解失衡以及攣縮增加。增生性瘢痕是纖維化疾病的一種,是皮膚損傷后創(chuàng)面修復(fù)過程異常反應(yīng)而導(dǎo)致的病理性愈合。皮膚損傷后,一系列細胞、細胞外基質(zhì)以及細胞因子在創(chuàng)面修復(fù)各個階段(炎癥期、肉芽形成期以及組織重塑期)中發(fā)揮不同的作用。創(chuàng)面愈合的組織重塑期可能持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年之久。在創(chuàng)面修復(fù)的三個階段,抗纖維化分子和促纖維化分子如生長因子、蛋白水解酶、細胞外基質(zhì)等相互作用。無論是成纖維細胞產(chǎn)生過度的膠原、糖蛋白及纖粘蛋白,還是細胞外基質(zhì)的降解及重塑缺失,都將導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的沉積與降解微平衡被破壞。創(chuàng)面持續(xù)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的增生性瘢痕,其特點是血管生成、細胞增多以及過度的膠原沉積。腎纖維化是慢性腎臟疾病的最終結(jié)局,其病理特點是腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮、腎小管周圍毛細血管稀疏以及炎性浸潤等。這些變化最終將導(dǎo)致腎實質(zhì)結(jié)構(gòu)徹底破壞以及腎功能衰竭。有研究證實了肌成纖維細胞在腎纖維化疾病中的重要作用,因為其不僅導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的過度沉積,還產(chǎn)生炎性因子及有毒氧基。肌成纖維細胞在上述條件下的腎間質(zhì)空隙中密集地積累并不斷合成基質(zhì)成分,同時破壞腎實質(zhì)以及微血管。目前,已經(jīng)證實能夠促進腎臟纖維化的因素包括上皮損傷、炎癥、先天以及適應(yīng)性免疫反應(yīng)。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化中的多種分子信號途徑與腎臟纖維化密切相關(guān),如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF),結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF),表皮生長因子(epidermal growth factor,egf),hedgehog(hh),gli,wnt以及notch等。在前期研究中,我們通過基因差異表達篩選出與瘢痕增生的相關(guān)基因p311,而eif6(integrinβ4bindingprotein,genbankidnm_002212)是其相互作用蛋白。與皮膚來源成纖維細胞相比,增生性瘢痕來源的成纖維細胞中eif6表達降低。在小鼠皮膚創(chuàng)面愈合過程中,eif6的低表達導(dǎo)致了創(chuàng)面修復(fù)過程中tgf-β1和α-sma表達上調(diào),肉芽組織過多形成,創(chuàng)面收縮的增強;在小鼠腎臟纖維化過程中,低表達eif6加速了小鼠腎纖維化進程,增強了tgf-β1的表達,促進了成纖維細胞和腎小管上皮細胞等向肌成纖維細胞分化�；趀if6參與胎兒皮膚發(fā)育、能夠抑制肌成纖維細胞的表型逆轉(zhuǎn)、抑制纖維化動物模型的創(chuàng)面纖維增生及腎臟纖維化的作用,我們提出eif6可能是纖維化的負性調(diào)節(jié)因子。eif6(又名eif6,p27bbp)是s.biffo等人在1997年利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究beta4整合素結(jié)合蛋白時發(fā)現(xiàn)的一種進化高度保守的蛋白,由單基因編碼。eif6是一種核糖體抗結(jié)合因子,能夠調(diào)節(jié)核糖體60亞基的活力以及80s亞基的形成,從而調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的起始過程以及核糖體的合成。northern分析及原位雜交證明eif6mrna在體內(nèi)高表達于人類上皮細胞系和小鼠胚胎的增殖胚芽上皮細胞中。至此之后不同的研究所對其基因、表達、結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)作用均作了研究。eif6mrna長度是1108bp,其開放閱讀框包含735核苷酸。熒光原位雜交技術(shù)證實了eif6的基因位于21號染色體長臂20q11.2區(qū)域,包含7個外顯子和6個內(nèi)含子,并且沒有tata盒結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及cpg島。在真核細胞中,eif6呈保守表達方式,不僅表達于人類、小鼠、大鼠、兔、非洲爪蟾等脊椎動物,還表達于果蠅、烏賊等無脊椎動物,并且在脊椎動物與無脊椎動物中eif6的結(jié)構(gòu)域高度保守。在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后,基因轉(zhuǎn)變成為成熟的mrna,然后在細胞漿中在核糖體翻譯成為多肽鏈。在真核細胞的生長與分化過程中,只有部分基因能夠表達,大部分基因都是以沉默狀態(tài)存在的。多個水平的mrna翻譯調(diào)節(jié)對蛋白質(zhì)翻譯均有重要作用,尤其在蛋白質(zhì)翻譯的起始階段。在細胞核內(nèi),eif6結(jié)合核糖體60s亞基,抑制80s亞基的合成,在蛋白翻譯的起始階段扮演真核啟動因子的角色。eif6在ck1-pkc的磷酸化作用下,核糖體60s與eif6解離,隨后與核糖體40s亞基結(jié)合形成80s。最終,蛋白質(zhì)的合成啟動。與之相反的是,如果eif6缺失,microrna對目的蛋白的抑制減輕,目的蛋白的表達加強。eif6蛋白的合成與microrna的調(diào)節(jié)相關(guān),通過eif6與risc結(jié)合,促進相關(guān)microrna的功能,mrna形成在轉(zhuǎn)錄水平受到干擾,目的蛋白合成抑制。研究表明,eif6不僅作為β整合素4的連接蛋白表達在胞漿內(nèi),還在胞核內(nèi)表達,與核糖體60s結(jié)合,eif6-60s復(fù)合物轉(zhuǎn)運出細胞核后,在胞漿內(nèi)通過rack1-pkcβii途徑釋放,與40s裝配形成80s,從而啟動了蛋白的合成。eif6持續(xù)表達于人類和墨魚的上皮細胞、成纖維細胞以及肌纖維等組織內(nèi)。在含有beta4整合素的上皮細胞中,eif6存在于胞漿區(qū)的半橋粒附近,與角蛋白中間絲結(jié)合,推測其可能為beta4整合素與細胞骨架胞的分子連接,與細胞骨架的形成相關(guān)。eif6同樣表達于核仁,是一種核基質(zhì)相關(guān)蛋白,參與形成核基質(zhì)纖維,eif6在體外以管家基因表達特性的方式持續(xù)穩(wěn)定表達,而在體內(nèi)卻受到高度調(diào)控,免疫組織化學(xué)分析顯示,同一器官或組織中的eif6表達具有細胞類型特異性,這種調(diào)節(jié)可能與組織特異性因子和蛋白合成途徑相關(guān)。在nih/3t3、jurkat、sk-n-mc、a431、hela、hacat、fg2和rin2a等細胞系以及人類原代成纖維細胞(臍帶來源)和小鼠靜息期脾細胞中均能檢測到eif6的持續(xù)性表達,eif6的缺失將導(dǎo)致g1細胞的累積,且與自由60s核糖體亞單位的丟失相關(guān)。已經(jīng)證實,p311是促進增生性瘢痕的細胞因子之一。在我們的前期研究中通過酵母雜交技術(shù)及熒光共振能量轉(zhuǎn)移篩選發(fā)現(xiàn),eif6是p311的結(jié)合蛋白,可能通過相反的作用影響增生性瘢痕的形成。在增生性瘢痕源性成纖維細胞中,eif6的表達較正常皮膚來源的成纖維細胞減低。在eif6敲降的小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型中,eif6的減少可以增加肌成纖維細胞的活化,增加膠原、α-sma以及tgf-β1的表達,從而促進纖維化的發(fā)生與發(fā)展。然而,由于eif6在高表達于周期細胞中,并且在體內(nèi)的表達受到高度調(diào)控,因此,在人增生性瘢痕及慢性腎小球腎炎中的表達是否與體外實驗一致尚不明確。因此,本研究擬分為以下三個方面研究eif6在燒傷病人不同時期增生性瘢痕中以及慢性腎小球腎炎腎小管/腎間質(zhì)纖維化中在時間與空間的表達規(guī)律:1)eif6在不同時期增生性瘢痕與同體正常皮膚的表達分布差異;2)eif6在不同時期增生性瘢痕與同體正常皮膚的表達含量差異;3)eif6在腎小管/腎間質(zhì)纖維化腎臟疾病組織中的表達分布特點及其與正常腎臟組織的差異。1、eif6在不同時期增生性瘢痕及正常皮膚組織中的表達分布差異首先,我們收集燒傷后不同時期增生性瘢痕以及同體正常皮膚組織樣本,通過免疫組織化學(xué)染色檢測eif6在其中的表達分布規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在正常皮膚組織中,eif6主要分布于包括基底層、棘細胞層、顆粒層、透明層和角化層的角質(zhì)形成細胞,其表達部位在細胞胞漿。與之不同的是,在增生性瘢痕中,雖然eif6同樣主要分布于表皮層,但其表達的強度明顯低于正常皮膚組織,更重要的是eif6在表皮的基底層的表達是陰性的。成熟期的瘢痕組織中,eif6的表達強度比增生期瘢痕有增高,但仍低于正常皮膚組織,在其分布上,基底層有少量eIF6陽性細胞。消退期瘢痕組織中,盡管eIF6的表達強度仍低于正常皮膚組織,但明顯高于增生期,且其表皮基底層有較多的e IF6陽性細胞分布。2、e IF6在不同時期增生性瘢痕與同體正常皮膚的表達含量差異本實驗對所收集燒傷后不同時期增生性瘢痕以及同體正常皮膚組織樣本中的eIF6表達量進行Western Blot定量分析。結(jié)果顯示:與正常皮膚組織相比,增生性瘢痕組織瘢痕中eIF6的表達量顯著下調(diào),這種下調(diào)的程度在增生期的瘢痕組織中最為顯著。雖然與正常皮膚組織相比,消退期瘢痕中eIF6的表達量仍是降低的,但較增生期的瘢痕有明顯的增加,這說明了eIF6的表達與增生性瘢痕形成有關(guān)聯(lián),結(jié)合臨床上增生性瘢痕從增生期開始增生、成熟期穩(wěn)定、消退期逐漸消退的過程,以及基礎(chǔ)研究結(jié)果提示eIF6通過TGF-β/Smad信號通路影響肌成纖維細胞的活化與分化,提示eIF6在人增生性瘢痕形成過程中的負性調(diào)控作用。3、eIF6在慢性腎小球腎炎纖維化腎臟組織中的表達分布差異收集不同纖維化程度的慢性腎小球腎炎腎臟穿刺標本,以中度及重度纖維化腎臟為實驗組,以相對正常的腎臟穿刺標本為對照組,分別檢測其eIF6的表達分布情況。結(jié)果顯示:在正常腎臟中,e IF6表達于腎小球、腎小管上皮細胞以及腎間質(zhì)細胞即:e IF6表達于腎皮質(zhì)腎小球球囊上皮細胞、近端小管、遠端小管上皮的細胞胞漿。此外,腎間質(zhì)細胞也有eIF6的陽性表達。而在慢性腎小球腎炎腎小管間質(zhì)纖維化的腎臟組織中,e IF6的總體表達較弱,腎小球球囊上皮細胞中未見e IF6的表達,腎小管上皮中e IF6的表達較正常腎小管上皮細胞弱。大多數(shù)纖維化腎臟組織中皮質(zhì)區(qū)腎小管間質(zhì)區(qū)域增寬,在該區(qū)域中e IF6的表達也是陰性,但纖維化旁的近端小管、遠端小管上皮細胞中eIF6的表達強于正常腎臟組織。綜上所述:通過檢測不同時期的增生性瘢痕中eIF6的表達分布與表達量的差異,我們發(fā)現(xiàn)在增生性瘢痕中eIF6的表達量低于正常皮膚,且e IF6的表達分布和表達量與增生性瘢痕的發(fā)展過程相關(guān)聯(lián)。在腎纖維化組織中,e IF6的表達分布比正常腎臟組織有差異,結(jié)合前期在單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)小鼠腎纖維化模型中我們發(fā)現(xiàn)eIF6的減少可促進膠原、TGF-β1和α-SMA的表達明顯增加,說明eIF6參與了人慢性腎小球腎炎纖維化的過程。所以,eIF6可能參與人體多種組織纖維化的過程,可能是未來我們調(diào)控纖維化疾病的治療靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692

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本文編號：1725739