本文選題：非酒精性脂肪性肝病　切入點：自噬　出處：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：第一部分NLRP3炎癥小體和自噬在NASH患者和小鼠肝臟中的表達目的:收集非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)患者肝組織標本,建立NASH小鼠模型,觀察NLRP3炎癥小體和自噬在NASH患者和小鼠肝臟中表達和激活水平的變化。方法:(1)術中收集NASH患者的肝組織標本和肝臟相對正�；颊吒闻K標本,蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)及油紅染色并通過NAFLD活動度評分標準將患者分為Ctrl組和NASH組,比較兩組患者血清甘油三酯、游離脂肪酸(Free fatty acid,FFA)和白細胞介素-1β(imerleukin-1β,IL-1β)的水平以及NLRP3炎癥小體和自噬相關蛋白的表達水平。(2)用HFD喂養(yǎng)小鼠建立NASH小鼠模型,并給予短期饑餓處理,HE染色及油紅染色觀察肝組織病理變化,透射電鏡觀察自噬小體激活情況,Western Blot(WB)檢測小鼠肝臟及Kupffer細胞(KCs)中NLRP3炎癥小體和自噬相關蛋白的表達水平。結果:(1)HE染色和電鏡可見NASH患者肝細胞有大量脂滴聚集,呈氣球樣變,NASH患者肝臟的P62、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平較正常肝組織有明顯升高(P0.01);LC3I向LC3II的轉化水平以及Beclin-1表達水平較正常組降低(P0.05)。(2)HE染色和油紅染色見NASH小鼠肝臟脂滴大量聚集,炎癥細胞浸潤;WB顯示NASH小鼠肝臟的P62、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平較正常肝組織有明顯升高(P0.01);電鏡和WB提示NASH小鼠肝臟自噬水平下降。WB結果提示短期饑餓組自噬相關蛋白表達較HFD組恢復,NLRP3炎癥小體激活減少。NASH患者和NASH小鼠血清IL-1β表達水平顯著增加(P0.01)。結論:NASH患者和NASH小鼠肝臟的NLRP3炎癥小體蛋白較正常肝臟表達升高,自噬相關蛋白表達水平下降。NASH患者和NASH小鼠血清IL-1β表達水平增加。NASH小鼠經(jīng)短期饑餓處理后自噬功能有所恢復,NLRP3炎癥小體激活有所減少。第二部分:激活自噬對Kupffer細胞中NLRP3炎癥小體激活的影響目的:探討在棕櫚酸(Palmitic acid,PA)刺激下的KCs中,不同激活水平的自噬對NLRP3炎癥小體激活和IL-1β分泌的影響。方法:分離培養(yǎng)KCs隨機分為6組:Ctrl組,普通培養(yǎng)基;DMSO組,含DMSO培養(yǎng)基;PA組,0.5m M PA刺激12h;PA+雷帕霉素組(PA+R),50μM雷帕霉素預刺激4h后0.5m M PA刺激12h;PA+渥曼青霉素組(PA+W),50μM渥曼青霉素預刺激4h后0.5m M PA刺激12h;PA+饑餓組(PA+STAR),不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)4h后0.5m M PA刺激12h。收集細胞及上清液,電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)及自噬小體形成情況,WB與q PCR檢測LC3、P62、Beclin-1、NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白和相關基因的表達,ELISA檢測細胞上清液IL-1β水平。結果:(1)透射電鏡可見PA組KCs胞質(zhì)中有雙層膜結構的自噬體形成。PA+W組細胞中脂滴體積較大,自噬小體較少。PA+R組細胞中自噬小體增多,脂滴體積較小。(2)m RFP-EGFP-LC3雙熒光標細胞顯示PA組自噬流增加;PA+R組自噬流增強;PA+W組明顯減弱。(3)WB結果顯示,PA組LC3II/LC3I和Beclin-1的表達都較Ctrl組有明顯增加(P0.01);P62,NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表達與Ctrl組相比也有顯著升高(P0.01)。PA+W組LC3II/LC3I和Beclin-1的表達較PA組明顯減弱(P0.01);NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表達與PA組比較顯著增加(P0.01),P62的表達比PA組增加也有統(tǒng)計學意義(P0.05)。PA+R組LC3II/LC3I和Beclin-1的表達與PA組沒有明顯差異(P0.05);P62、ASC和caspase-1蛋白的表達與PA組比較顯著下降(P0.01),NLRP3的表達與PA組比較也無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(4)q PCR結果顯示,PA組ATG5、ATG7和Beclin-1的m RNA表達都較Ctrl組有明顯增加(P0.01);P62,NLRP3、ASC和caspase-1表達與Ctrl組相比也有顯著升高(P0.01)。PA+W組ATG5、ATG7和Beclin-1的表達較PA組減弱(P0.05);P62、NLRP3、ASC和caspase-1的m RNA表達與PA組比較增加(P0.05)。PA+R組ATG5、ATG7和Beclin-1的表達與PA比較明顯增加(P0.05);P62、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表達與PA組比較下降。(5)ELISA結果示:PA組IL-1β水平較Ctrl組升高(P0.01)。PA+W組IL-1β水平較PA組明顯升高(P0.01);PA+R組IL-1β水平較PA組顯著降低(P0.01)。結論:PA刺激KCs使NLRP3炎癥小體和自噬激活增加。用雷帕霉素激活自噬,可以抑制NLRP3炎癥小體的激活,以及IL-1β的分泌。相反,用渥曼青霉素抑制自噬,則促進NLRP3炎癥小體的激活和IL-1β分泌。第三部分:腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)通過泛素化介導自噬對NLRP3炎癥小體激活的調(diào)控目的:探討PA刺激下自噬和NLRP3炎癥小體互相作用機制,以及TRAF6在其中的作用。方法:激光共聚焦顯微鏡觀察NASH患者和NASH小鼠肝臟自噬相關蛋白和炎癥小體相關蛋白的共定位;免疫共沉淀檢測PA刺激前后ASC蛋白與LC3、Beclin-1、P62的互相作用關系;WB檢測PA刺激前后ASC泛素化水平;構建載有TRAF6-sh RNA的慢病毒質(zhì)粒沉默TRAF6,用免疫共沉淀和WB檢測沉默TRAF6后ASC泛素化水平的變化。結果:激光共聚焦顯微鏡觀察在NASH患者和NASH小鼠肝臟存在自噬和炎癥小體共定位;免疫共沉淀結果顯示PA刺激后ASC蛋白與LC3、Beclin-1、P62形成共聚體的量較刺激前增加;WB檢測結果表明,PA刺激后ASC總泛素化、K63泛素化和K48泛素化水平都增強;慢病毒沉默TRAF6后發(fā)現(xiàn)ASC總泛素化、K63泛素化和K48泛素化水平較PA組下降,且以K63泛素化下降為主。結論:PA刺激下,LC3與NLRP3炎癥小體形成的共聚體的量較刺激前明顯增加,P62與NLRP3炎癥小體形成的共聚體的量也較刺激前明顯增加,K63和K48泛素化可能參與其中。TRAF6在一定程度上調(diào)控對ASC的K63泛素化,促進P62將泛素化的ASC識別,進而轉運至自噬體降解。
[Abstract]:Methods : ( 1 ) To investigate the expression of NLRP3 inflammatory and self - autophagy - related proteins in NASH patients and mice . Methods : ( 1 ) To observe the changes of expression and activation of NLRP3 inflammation bodies and autophagy in NASH patients . Methods : ( 1 ) The expression levels of serum triglyceride , free fatty acid ( FFA ) and interleukin - 1尾 ( imerthiazol - 1尾 , IL - 1尾 ) in liver tissues and liver tissues of NASH patients were observed by Western Blot ( WB ) . Results : ( 1 ) The levels of serum triglyceride , free fatty acid ( FFA ) and interleukin - 1尾 ( imercer - 1尾 , IL - 1尾 ) in liver and liver of mice were observed by Western Blot ( WB ) . The levels of serum IL - 1尾 in NASH and NASH mice were significantly increased ( P0.01 ) . Compared with the control group , the expression of ATG5 , ATG7 and Beclin - 1 in PA + R group was significantly higher than that in the control group ( P0.01 ) . The levels of IL - 1尾 and IL - 1尾 in the patients with NASH and NASH were significantly higher than those in PA group ( P0.01 ) .

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R575

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本文編號：1702479