LAMP3介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在絨癌侵襲遷移中的作用及機(jī)制研究
本文選題:EMT 切入點(diǎn):絨癌 出處:《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文
【摘要】:由于有效治療措施如化療的出現(xiàn)及人絨毛膜促性腺激素作為腫瘤標(biāo)記物的廣泛應(yīng)用,妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(Gestational trophoblastic neoplasia,GTN)成為有可能僅依靠化療治愈的第一個婦科實(shí)體瘤,也是人類最早得以治愈的實(shí)體瘤之一。然而,仍然會有患者因?yàn)槌霈F(xiàn)化療耐藥和多發(fā)轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致疾病進(jìn)展。其中,轉(zhuǎn)移性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤主要經(jīng)血行播散,轉(zhuǎn)移發(fā)生早而且廣泛,可同時出現(xiàn)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶,而且很多患者原發(fā)灶消失,僅表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶癥狀,使疾病的診斷和治療都變得更加困難。近年來學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為,絨癌轉(zhuǎn)移是多基因、多信號通路共同作用的結(jié)果,但具體機(jī)制尚不明確。因此,探討絨癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制,尋找阻斷或逆轉(zhuǎn)絨癌侵襲的新靶點(diǎn),對改善絨癌患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。溶酶體相關(guān)膜蛋白 3(1ysosomal associated membrane protein3,LAMP3)是一種高度糖基化的完整跨膜蛋白,主要位于細(xì)胞內(nèi)的溶酶體膜上,其僅僅在少數(shù)幾種細(xì)胞或者某些細(xì)胞的特定分化階段表達(dá)。但是最近相關(guān)的體內(nèi)體外試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn),LAMP3可能在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用,與腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)。亦有研究發(fā)現(xiàn)LAMP3是一種新的低氧調(diào)節(jié)基因,參與低氧誘導(dǎo)的腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。文獻(xiàn)報(bào)道低氧也可以誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞發(fā)生EMT。LAMP3作為新的低氧調(diào)節(jié)基因是否在絨癌細(xì)胞的EMT中發(fā)揮作用需要進(jìn)一步的研究。首先,本研究通過RT-PCR和免疫印跡法發(fā)現(xiàn)絨癌細(xì)胞JEG-3中LAMP3的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于HTR-8/SVneo(P0.05),而HTR-8/SVneo被公認(rèn)為具有更強(qiáng)的侵襲能力,提示LAMP3的表達(dá)水平與細(xì)胞侵襲能力呈正相關(guān)。同時,通過CCK-8、RT-PCR、免疫印跡法和體外侵襲遷移實(shí)驗(yàn)如Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)等研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)后絨癌細(xì)胞JEG-3中LAMP3的表達(dá)增加,細(xì)胞侵襲遷移能力增強(qiáng)。研究提示LAMP3的表達(dá)可能和JEG-3細(xì)胞的侵襲遷移能力呈正相關(guān)。其次,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別構(gòu)建過表達(dá)和敲減LAMP3的JEG-3細(xì)胞,并通過體外侵襲遷移實(shí)驗(yàn)如Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)等檢測不同細(xì)胞的侵襲遷移能力、并在過表達(dá)LAMP3后檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性,另外通過RT-PCR和免疫印跡法檢測不同細(xì)胞的EMT相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,過表達(dá)LAMP3可以通過在絨癌細(xì)胞JEG-3中介導(dǎo)EMT的激活促進(jìn)其侵襲、遷移、耐藥等表型;而對LAMP3敲減后,則會誘導(dǎo)相反的MET過程,使JEG-3細(xì)胞的侵襲遷移表型減弱。研究結(jié)果表明,LAMP3可以通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)絨癌細(xì)胞JEG-3的侵襲遷移。最后,通過免疫印跡法分別對過表達(dá)和敲減LAMP3后以及分別應(yīng)用小分子抑制劑XAV939和重組人Wnt-3a蛋白后的JEG-3細(xì)胞進(jìn)行β-catenin和Wnt通路的相關(guān)靶基因蛋白表達(dá)的測定。結(jié)果表明,LAMP3的表達(dá)通過影響JEG-3細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的激活參與了對EMT的調(diào)控,這種調(diào)控作用可能是通過對EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist和Snail的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的,同時也涉及MMP2及MMP9相關(guān)表達(dá)的改變。研究提示,Wnt信號通路參與了 LAMP3對JEG-3細(xì)胞EMT的調(diào)控。研究結(jié)果表明,LAMP3的表達(dá)可能和JEG-3細(xì)胞的侵襲遷移能力呈正相關(guān),LAMP3可以通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)絨癌細(xì)胞JEG-3的侵襲遷移,而Wnt信號通路參與了 LAMP3對JEG-3細(xì)胞EMT的調(diào)控;針對Wnt通路相關(guān)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的藥物可能會在轉(zhuǎn)移性絨癌的治療中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:Because effective treatments such as chemotherapy and human chorionic gonadotropin used as tumor markers, gestational trophoblastic tumor (Gestational trophoblastic, neoplasia, GTN) have become impossible to rely on only the first chemotherapy cure gynecological tumor, is one of the earliest human solid tumors to cure. However, there will still be because of the emergence of resistance to chemotherapy and patients with multiple metastases and lead to disease progression. The metastatic trophoblastic tumor hematogenous spread, early metastasis can occur simultaneously and widely, the primary and metastatic cancer, and many patients with primary lesions disappeared, only showed metastatic symptoms, the diagnosis and treatment of diseases are it becomes more difficult. In recent years, academic circles generally believe that the transfer of choriocarcinoma is a multi gene, the interaction of multiple signaling pathways, but the specific mechanism is not clear. Therefore, to investigate the invasion of choriocarcinoma The occurrence mechanism of angiogenesis, to find a new target for preventing or reversing the invasion of choriocarcinoma, has important clinical significance for improving the prognosis of patients with choriocarcinoma. Lysosome associated membrane protein 3 (1ysosomal associated membrane protein3, LAMP3) is a highly glycosylated transmembrane protein lysosomal membrane integrity, mainly located inside the cell. The only expression in the differentiation stage specific a few cells or some cells. But in vivo and in vitro experiments recently related were found, LAMP3 may play an important role in tumor invasion and metastasis of tumor, and the prognosis is closely related. Studies have found that LAMP3 is a new gene transfer process in hypoxic regulation. Hypoxia induced tumors. Hypoxia can induce the reported EMT.LAMP3 as the new hypoxia regulating gene can play a role in choriocarcinoma cell EMT in choriocarcinoma cells To further study. Firstly, the study by RT-PCR and Western blotting indicated the expression of mRNA and LAMP3 protein in choriocarcinoma cell JEG-3 was significantly lower than that of HTR-8/SVneo (P0.05), HTR-8/SVneo is recognized as the aggressive ability, suggesting that the expression of LAMP3 and cell invasion ability was positively correlated. At the same time, through the CCK-8, RT-PCR Western blotting, in vitro invasion and migration experiments such as Transwell, on the scratch test found increased LAMP3 expression in choriocarcinoma cell induced by JEG-3 after hypoxia in the cell invasion and migration ability. Studies suggest that expression of LAMP3 and JEG-3 cell invasion and migration ability were positively correlated. Secondly, through plasmid transfection and lentivirus transfection technology were constructed JEG-3 expression and knockdown of LAMP3, and the in vitro invasion and migration experiments such as Transwell, scratch test. The cell migration and invasion, And in the expression of sensitivity of cells to chemotherapeutic drugs LAMP3, the expression of EMT related genes RT-PCR and immunoblotting in different cells. The results showed that the migration of over expression of LAMP3 by activating JEG-3 mediated EMT in choriocarcinoma cells promote its invasion, drug resistance phenotype of knockdown of LAMP3; when will the MET process induced by the contrary, the invasion and migration of JEG-3 cell phenotype is weakened. The results show that the LAMP3 can promote the invasion and migration of EMT induced by JEG-3 choriocarcinoma cells. Finally, through Western blot respectively for overexpression and knockdown of LAMP3 and were applied to small molecule inhibitors of XAV939 and recombinant human Wnt-3a protein the JEG-3 cells to determine the expression of target beta -catenin and Wnt pathway protein. The results showed that the expression of LAMP3 in JEG-3 cells by affecting Wnt/ beta -catenin pathway activation. With the control of EMT, the regulation may be achieved through the regulation of EMT transcription factor Twist and Snail, also involving MMP2 and MMP9 related expression changes. Studies suggest that Wnt signaling pathway is involved in the regulation of LAMP3 on JEG-3 EMT cells. The results showed that expression of LAMP3 and JEG-3 cells may the invasion ability was positively related to LAMP3 can induce EMT to promote invasion of choriocarcinoma cells JEG-3, Wnt signaling pathway is involved in the regulation of LAMP3 on JEG-3 cell EMT; drug target design for Wnt pathway may play an important role in the treatment of metastatic choriocarcinoma.
【學(xué)位授予單位】:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2017
【分類號】:R737.33
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,本文編號:1700727
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