本文選題：EMT　切入點：絨癌　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文

【摘要】：由于有效治療措施如化療的出現(xiàn)及人絨毛膜促性腺激素作為腫瘤標記物的廣泛應用,妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤(Gestational trophoblastic neoplasia,GTN)成為有可能僅依靠化療治愈的第一個婦科實體瘤,也是人類最早得以治愈的實體瘤之一。然而,仍然會有患者因為出現(xiàn)化療耐藥和多發(fā)轉移而導致疾病進展。其中,轉移性滋養(yǎng)細胞腫瘤主要經(jīng)血行播散,轉移發(fā)生早而且廣泛,可同時出現(xiàn)原發(fā)灶和轉移灶,而且很多患者原發(fā)灶消失,僅表現(xiàn)為轉移灶癥狀,使疾病的診斷和治療都變得更加困難。近年來學術界普遍認為,絨癌轉移是多基因、多信號通路共同作用的結果,但具體機制尚不明確。因此,探討絨癌侵襲轉移的發(fā)生機制,尋找阻斷或逆轉絨癌侵襲的新靶點,對改善絨癌患者的預后具有重要的臨床意義。溶酶體相關膜蛋白 3(1ysosomal associated membrane protein3,LAMP3)是一種高度糖基化的完整跨膜蛋白,主要位于細胞內(nèi)的溶酶體膜上,其僅僅在少數(shù)幾種細胞或者某些細胞的特定分化階段表達。但是最近相關的體內(nèi)體外試驗均發(fā)現(xiàn),LAMP3可能在腫瘤的侵襲轉移中發(fā)揮著重要的作用,與腫瘤的預后不良密切相關。亦有研究發(fā)現(xiàn)LAMP3是一種新的低氧調(diào)節(jié)基因,參與低氧誘導的腫瘤的轉移過程。文獻報道低氧也可以誘導絨癌細胞發(fā)生EMT。LAMP3作為新的低氧調(diào)節(jié)基因是否在絨癌細胞的EMT中發(fā)揮作用需要進一步的研究。首先,本研究通過RT-PCR和免疫印跡法發(fā)現(xiàn)絨癌細胞JEG-3中LAMP3的mRNA和蛋白表達水平明顯低于HTR-8/SVneo(P0.05),而HTR-8/SVneo被公認為具有更強的侵襲能力,提示LAMP3的表達水平與細胞侵襲能力呈正相關。同時,通過CCK-8、RT-PCR、免疫印跡法和體外侵襲遷移實驗如Transwell、劃痕實驗等研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導后絨癌細胞JEG-3中LAMP3的表達增加,細胞侵襲遷移能力增強。研究提示LAMP3的表達可能和JEG-3細胞的侵襲遷移能力呈正相關。其次,通過質粒轉染和慢病毒轉染技術分別構建過表達和敲減LAMP3的JEG-3細胞,并通過體外侵襲遷移實驗如Transwell、劃痕實驗等檢測不同細胞的侵襲遷移能力、并在過表達LAMP3后檢測細胞對化療藥物的敏感性,另外通過RT-PCR和免疫印跡法檢測不同細胞的EMT相關基因的表達情況。結果顯示,過表達LAMP3可以通過在絨癌細胞JEG-3中介導EMT的激活促進其侵襲、遷移、耐藥等表型;而對LAMP3敲減后,則會誘導相反的MET過程,使JEG-3細胞的侵襲遷移表型減弱。研究結果表明,LAMP3可以通過誘導EMT促進絨癌細胞JEG-3的侵襲遷移。最后,通過免疫印跡法分別對過表達和敲減LAMP3后以及分別應用小分子抑制劑XAV939和重組人Wnt-3a蛋白后的JEG-3細胞進行β-catenin和Wnt通路的相關靶基因蛋白表達的測定。結果表明,LAMP3的表達通過影響JEG-3細胞中Wnt/β-catenin通路的激活參與了對EMT的調(diào)控,這種調(diào)控作用可能是通過對EMT轉錄因子Twist和Snail的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的,同時也涉及MMP2及MMP9相關表達的改變。研究提示,Wnt信號通路參與了 LAMP3對JEG-3細胞EMT的調(diào)控。研究結果表明,LAMP3的表達可能和JEG-3細胞的侵襲遷移能力呈正相關,LAMP3可以通過誘導EMT促進絨癌細胞JEG-3的侵襲遷移,而Wnt信號通路參與了 LAMP3對JEG-3細胞EMT的調(diào)控;針對Wnt通路相關靶點設計的藥物可能會在轉移性絨癌的治療中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:Because effective treatments such as chemotherapy and human chorionic gonadotropin used as tumor markers, gestational trophoblastic tumor (Gestational trophoblastic, neoplasia, GTN) have become impossible to rely on only the first chemotherapy cure gynecological tumor, is one of the earliest human solid tumors to cure. However, there will still be because of the emergence of resistance to chemotherapy and patients with multiple metastases and lead to disease progression. The metastatic trophoblastic tumor hematogenous spread, early metastasis can occur simultaneously and widely, the primary and metastatic cancer, and many patients with primary lesions disappeared, only showed metastatic symptoms, the diagnosis and treatment of diseases are it becomes more difficult. In recent years, academic circles generally believe that the transfer of choriocarcinoma is a multi gene, the interaction of multiple signaling pathways, but the specific mechanism is not clear. Therefore, to investigate the invasion of choriocarcinoma The occurrence mechanism of angiogenesis, to find a new target for preventing or reversing the invasion of choriocarcinoma, has important clinical significance for improving the prognosis of patients with choriocarcinoma. Lysosome associated membrane protein 3 (1ysosomal associated membrane protein3, LAMP3) is a highly glycosylated transmembrane protein lysosomal membrane integrity, mainly located inside the cell. The only expression in the differentiation stage specific a few cells or some cells. But in vivo and in vitro experiments recently related were found, LAMP3 may play an important role in tumor invasion and metastasis of tumor, and the prognosis is closely related. Studies have found that LAMP3 is a new gene transfer process in hypoxic regulation. Hypoxia induced tumors. Hypoxia can induce the reported EMT.LAMP3 as the new hypoxia regulating gene can play a role in choriocarcinoma cell EMT in choriocarcinoma cells To further study. Firstly, the study by RT-PCR and Western blotting indicated the expression of mRNA and LAMP3 protein in choriocarcinoma cell JEG-3 was significantly lower than that of HTR-8/SVneo (P0.05), HTR-8/SVneo is recognized as the aggressive ability, suggesting that the expression of LAMP3 and cell invasion ability was positively correlated. At the same time, through the CCK-8, RT-PCR Western blotting, in vitro invasion and migration experiments such as Transwell, on the scratch test found increased LAMP3 expression in choriocarcinoma cell induced by JEG-3 after hypoxia in the cell invasion and migration ability. Studies suggest that expression of LAMP3 and JEG-3 cell invasion and migration ability were positively correlated. Secondly, through plasmid transfection and lentivirus transfection technology were constructed JEG-3 expression and knockdown of LAMP3, and the in vitro invasion and migration experiments such as Transwell, scratch test. The cell migration and invasion, And in the expression of sensitivity of cells to chemotherapeutic drugs LAMP3, the expression of EMT related genes RT-PCR and immunoblotting in different cells. The results showed that the migration of over expression of LAMP3 by activating JEG-3 mediated EMT in choriocarcinoma cells promote its invasion, drug resistance phenotype of knockdown of LAMP3; when will the MET process induced by the contrary, the invasion and migration of JEG-3 cell phenotype is weakened. The results show that the LAMP3 can promote the invasion and migration of EMT induced by JEG-3 choriocarcinoma cells. Finally, through Western blot respectively for overexpression and knockdown of LAMP3 and were applied to small molecule inhibitors of XAV939 and recombinant human Wnt-3a protein the JEG-3 cells to determine the expression of target beta -catenin and Wnt pathway protein. The results showed that the expression of LAMP3 in JEG-3 cells by affecting Wnt/ beta -catenin pathway activation. With the control of EMT, the regulation may be achieved through the regulation of EMT transcription factor Twist and Snail, also involving MMP2 and MMP9 related expression changes. Studies suggest that Wnt signaling pathway is involved in the regulation of LAMP3 on JEG-3 EMT cells. The results showed that expression of LAMP3 and JEG-3 cells may the invasion ability was positively related to LAMP3 can induce EMT to promote invasion of choriocarcinoma cells JEG-3, Wnt signaling pathway is involved in the regulation of LAMP3 on JEG-3 cell EMT; drug target design for Wnt pathway may play an important role in the treatment of metastatic choriocarcinoma.

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

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本文編號：1700727