本文選題：人乳頭瘤病毒　切入點(diǎn)：長調(diào)控區(qū)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：頭頸部惡性腫瘤(head and neck squamous cell carcinoma, HNS CC)是常見的惡性腫瘤,主要包括口咽癌、喉癌、下咽癌、口腔癌、鼻咽癌等。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)已被證實(shí)具有致癌性,持續(xù)感染高危型HPV-16/18是除過度吸煙和飲酒外的另一個(gè)被確認(rèn)的頭頸鱗癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。頭頸鱗癌中約20%-30%的患者發(fā)病與感染HPV相關(guān),世界范圍內(nèi)約70%的口咽鱗癌內(nèi)檢測到HPV感染。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)無煙酒嗜好的頭頸鱗癌患者,尤其是年輕患者較前增多,HPV感染與部分頭頸鱗癌的關(guān)系已越來越被重視。近年國外較多的流行病學(xué)研究報(bào)道了HPV在頭頸腫瘤中的感染率,其因地區(qū)、種族、生活習(xí)慣等而有差別,而不同的檢測方法,標(biāo)本收集時(shí)間也可導(dǎo)致HPV感染率出現(xiàn)較大的差別。研究一個(gè)地區(qū)內(nèi)頭頸腫瘤中的HPV感染率有利于該地區(qū)的腫瘤的防治；此外,準(zhǔn)確地篩選出HPV陽性頭頸腫瘤標(biāo)本,也是后續(xù)研究HPV相關(guān)頭頸腫瘤的致癌機(jī)制、分子標(biāo)記物等的必需過程。本課題中,我們采用高敏感度PCR擴(kuò)增的方法,使用新鮮冰凍標(biāo)本,檢測HPV在頭頸病變中的感染率,并進(jìn)一步分析HPV陽性頭頸部病變患者的臨床特征。喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,其中鱗狀細(xì)胞癌占96%-98%。世界范圍內(nèi),喉癌患者中HPV的感染率波動(dòng)很大,處于3%-60%之間�，F(xiàn)有研究提示中國喉癌患者中可能有較高的HPV感染率,中國喉癌患者與HPV感染的相關(guān)性可能更加緊密；例如,近期一篇薈萃分析報(bào)道世界范圍內(nèi)高危型HPV的感染率為26.6%,其中納入了3篇來自中國人群的研究文獻(xiàn),其感染率分別是58.8%,36.4%和41.67%,均高于歐美的平均感染率。但是,現(xiàn)有的關(guān)于中國喉癌中HPV感染率的研究報(bào)道明顯少于歐美國家以及日本,并且各項(xiàng)研究在樣本量、標(biāo)本保存方法、檢測手段、HPV分型等方面并不統(tǒng)一,所報(bào)道的HPV感染率也差別較大。此外,盡管有些研究發(fā)現(xiàn)喉癌中HPV感染率較高,但HPV感染與喉癌發(fā)病的相關(guān)性尚存在爭議。為了評(píng)估中國喉癌患者整體中的HPV感染率,并進(jìn)一步評(píng)價(jià)HPV感染與喉癌發(fā)生的相關(guān)性,本課題進(jìn)行了中國喉癌患者中HPV感染率的薈萃分析,并進(jìn)一步分析探討HPV感染與喉癌的相關(guān)性。HPV-16基因包含編碼早期蛋白(E1,E2,E4,E5,E6,E7),晚期蛋白(L1,L2)和一個(gè)非編碼調(diào)控區(qū)基因。其中,長調(diào)控區(qū)(long control region, LCR)是HPV維持病毒復(fù)制周期的重要的調(diào)控結(jié)構(gòu),其序列包含病毒轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子,促進(jìn)子和復(fù)制起點(diǎn),以及包含E2結(jié)合位點(diǎn)(E2 binding site, E2BS)在內(nèi)的多種調(diào)節(jié)元件的結(jié)合位點(diǎn)。E6和E7是HPV-16主要的癌基因,E6和E7蛋白可以分別與腫瘤抑癌蛋白p53和pRb結(jié)合,并使其降解而發(fā)揮致癌作用以及維持腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。E2是HPV病毒重要的調(diào)節(jié)基因,E2蛋白可以通過與位于LCR區(qū)的4個(gè)E2BS位點(diǎn)(E2BS-1, E2BS-2, E2BS-3, E2BS-4)結(jié)合,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的作用,并且可以抑制E6和E7癌蛋白的過度表達(dá)。DNA甲基化修飾(DNA methylation modification)是表觀遺傳學(xué)修飾(epigenetic)的一種重要表現(xiàn)形式,亦是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)的一種重要方式。抑癌基因啟動(dòng)子的CpG位點(diǎn)的甲基化是導(dǎo)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活的重要原因之一,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。新近有研究發(fā)現(xiàn),與HPV陰性腫瘤細(xì)胞相比,HPV陽性腫瘤細(xì)胞的基因的整體甲基化水平更高；HPV-DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后也往往發(fā)生甲基化,宮頸癌中HPV-16 LCR的甲基化水平與宮頸腫瘤的嚴(yán)重性密切相關(guān),說明HPV-DNA的甲基化與腫瘤的病變進(jìn)展密切相關(guān)。由于LCR是HPV病毒中重要的調(diào)控結(jié)構(gòu),LCR區(qū)E2BS內(nèi)的CpG位點(diǎn)的高甲基化可以影響E2蛋白結(jié)合到E2BS,從而影響發(fā)揮對(duì)癌基因E6和E7的表達(dá)抑制。所以,LCR區(qū)的甲基化與HPV陽性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后都密切相關(guān)。頭頸部鱗癌與宮頸癌二者在發(fā)生發(fā)展、腫瘤的生物學(xué)特性、治療及預(yù)后等各方面均有較大差別。然而,即使是在宮頸癌中,關(guān)于HPV-16 LCR區(qū)甲基化狀態(tài)的研究亦有較多不一致的結(jié)果。在現(xiàn)有研究中,頭頸鱗癌中HPV-16 LCR的甲基化狀態(tài)的研究結(jié)果相當(dāng)有限。在頭頸鱗癌中,CPSCC (oropharygeal squamous cell carcinoma, OPSCC)與HPV感染的關(guān)系最為密切。檢測HPV-16陽性的OPSCC標(biāo)本中LCR區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),尤其是LCR區(qū)E2BS位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),有助于研究HPV基因的甲基化在癌變過程中的作用,檢測LCR內(nèi)的CpG位點(diǎn)的甲基化分布特征,可以進(jìn)一步分析其與腫瘤的臨床特征的關(guān)系。此外,迄今為止,尚無研究報(bào)道HPV陽性頭頸鱗癌細(xì)胞中LCR內(nèi)的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),而檢測不同HPV-16陽性腫瘤細(xì)胞中的LCR區(qū)甲基化狀態(tài),有利于建立各種研究HPV基因甲基化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?并進(jìn)一步探討病毒基因甲基化狀態(tài)的對(duì)腫瘤的影響以及治療等。癌基因E6和E7的轉(zhuǎn)錄主要受E2蛋白調(diào)節(jié)控制,E2蛋白通過與位于Promoter區(qū)內(nèi)的E2BS-3和E2BS-4結(jié)合而發(fā)揮作用；此外,NF-1, AP1, Tef等多種調(diào)控原件也通過與位于Enhancer區(qū)內(nèi)的受體結(jié)合參與到調(diào)節(jié)E6和E7轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)中。甲基化的CpG (meCpG)位點(diǎn)往往導(dǎo)致基因功能上的改變,由于CpG位點(diǎn)的甲基化是一個(gè)可逆的過程,所以通過去甲基化試劑逆轉(zhuǎn)HPV陽性腫瘤細(xì)胞的LCR區(qū)內(nèi)的meCpG位點(diǎn)的高甲基化狀態(tài),可以恢復(fù)LCR的調(diào)節(jié)功能,這不僅有助于研究LCR區(qū)的甲基化在維持腫瘤細(xì)胞的生長增殖等腫瘤特性中的作用,并有可能成為HPV陽性頭頸腫瘤一個(gè)有效的治療措施。CaSki, SiHa細(xì)胞株是最常用的HPV-16陽性宮頸癌細(xì)胞株,近年來,有學(xué)者嘗試使用去甲基化試劑逆轉(zhuǎn)上述細(xì)胞中HPV-LCR內(nèi)meCpG位點(diǎn)的甲基化,從而研究甲基化狀態(tài)對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響,然而不同的細(xì)胞株之間,甚至使用相同細(xì)胞株的不同研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不完全一致�，F(xiàn)有研究提示,逆轉(zhuǎn)LCR區(qū)內(nèi)的meCpG位點(diǎn),不同的HPV陽性宮頸癌細(xì)胞,在生長、形態(tài)特性以及癌基因E6,E7的表達(dá)上可能不同,這可能與LCR區(qū)的甲基化狀態(tài)有關(guān)。然而,HPV陽性頭頸鱗癌細(xì)胞株較難建立,并且現(xiàn)有的絕大多數(shù)HPV陽性細(xì)胞株仍未商業(yè)化,至今尚無研究報(bào)道HPV陽性頭頸鱗癌細(xì)胞的LCR區(qū)的甲基化狀態(tài)以及細(xì)胞對(duì)去甲基化試劑的反應(yīng)。本課題使用HPV-16陽性口咽鱗癌細(xì)胞株UM-SCC47,在給予去甲基化試劑處理逆轉(zhuǎn)meCpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)后,研究UM-SCC47細(xì)胞的生物學(xué)特征以及癌基因E6和E7的變化,來探討HPV-16LCR甲基化狀態(tài)對(duì)HPV陽性頭頸腫瘤細(xì)胞的影響,并通過比較HPV陽性細(xì)胞不同的甲基化狀態(tài)對(duì)去甲基化處理的不同反應(yīng),探討HPV基因的甲基化的致癌機(jī)理。此外,本研究還探討逆轉(zhuǎn)LCR區(qū)meCpG甲基化作為HPV陽性細(xì)胞的治療措施的可行性。第一章頭頸腫瘤中HPV感染的流行病學(xué)分析第1部分頭頸部病變中HPV的檢測及臨床特征分析研究目的：檢測頭頸部病變組織中的HPV-DNA,分析HPV在頭頸部病變中的感染情況,并分析HPV陽性頭頸腫瘤的臨床特性。研究方法：收集自2013年7月至2014年4月于日本琉球大學(xué)耳鼻喉科門診或病房治療的頭頸部病變患者的組織標(biāo)本,共180例,包括頭頸腫瘤163例,非腫瘤良性病變包括炎癥以及非典型增生等14例,喉乳頭狀瘤3例。頭頸腫瘤標(biāo)本中包括頭頸鱗癌83例,咽喉部腺瘤5例,頭頸部淋巴瘤16例,原發(fā)不明癌7例,腮腺腫瘤29例,頜下腺腫瘤4例,外耳腫瘤8例。所有標(biāo)本活檢離體后立即儲(chǔ)存于液氮中。提取上述組織標(biāo)本的DNA,并評(píng)估DNA質(zhì)量。使用兩對(duì)HPV共通型引物GP5+/GP6+和MY09/MY11進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增檢測HPV-DNA,分別選用HPV-16陽性細(xì)胞CaSki和HPV陰性細(xì)胞HN041的DNA作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。所有PCR陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物均需測序確定為HPV序列,并且與現(xiàn)有HPV亞型的序列比對(duì),確定HPV亞型。結(jié)果：喉乳頭瘤組織中HPV感染率最高,達(dá)到100%(3/3),均為低危型HPV-6感染。頭頸鱗癌標(biāo)本中,HPV平均感染率為22.9%(19/64),且均為高危型HPV-16感染,其中口咽癌患者感染率最高,達(dá)到36.0%(9/25),下咽癌的感染率為21.7%(5/23),鼻咽癌的感染率為20.0%(1/5),口腔癌的感染為17.4%(4/23),但是7例喉鱗癌組織中均未檢測到HPV感染。此外,咽喉部腺癌(5例)、咽喉部良性病變(14例)、頭頸部淋巴瘤(16例)組織中均各有1例檢測到HPV-16 DNA；而甲狀腺腫瘤(11例),腮腺腫瘤(29例),頜下腺腫瘤(4例),外耳道腫瘤(8例)以及原發(fā)不明癌(7例)組織中均未檢測到HPV感染。經(jīng)分析,HPV陽性頭頸鱗癌患者的T分期較早,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)；HPV陽性頭頸鱗癌患者中低年齡段患者(≤55歲)比例高于HPV陰性頭頸鱗癌患者,差異處于有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨界值(P=0.074)。結(jié)論：喉乳頭狀瘤與HPV-6感染有明確相關(guān)性；部分頭頸鱗癌與HPV感染相關(guān),其中口咽癌最為密切,而喉癌與HPV感染關(guān)系尚不能確定；腮腺和甲狀腺腫瘤與HPV感染無明顯相關(guān)。第2部分中國喉癌中HPV感染率及HPV感染與喉癌相關(guān)性的薈萃分析研究目的：研究中國喉癌患者群體的高危型HPV-16/18感染率,并評(píng)估HPV-16/18感染與喉癌發(fā)病的相關(guān)性。研究方法：檢索各種常用中英文數(shù)據(jù)庫,按照預(yù)先制定的方案篩選相關(guān)文獻(xiàn),共納入22篇符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)。根據(jù)研究開始前制定的方案提取相關(guān)數(shù)據(jù)。使用R3.0軟件進(jìn)行薈萃分析,分析喉癌患者中HPV-16/18的陽性率。進(jìn)一步篩選病例-對(duì)照研究,共12篇文獻(xiàn)符合納入標(biāo)準(zhǔn),提取相關(guān)數(shù)據(jù),進(jìn)行薈萃分析評(píng)估HPV-16/18感染與喉癌發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果：喉癌患者中HPV-16/18陽性率的薈萃分析中,共提取到1477例喉癌病例,感染率為30.1%(95%CI：24.2%-36.8%)。評(píng)估高危型HPV-16/18感染的風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)的薈萃分析中,一共提取到1040例喉癌病例和735例對(duì)照病例,喉癌組及對(duì)照組感染率分別為31.1%和5.0%,OR為8.07(95%CI：5.67-11.48),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。結(jié)論：中國喉癌患者群體中有較高的HPV-16/18感染率；HPV-16/18的感染明顯增加了中國人群中喉癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。第二章HPV-16陽性腫瘤細(xì)胞和口咽鱗癌中HPV-16長調(diào)控區(qū)的甲基化狀態(tài)分析研究目的:檢測HPV-16陽性腫瘤細(xì)胞株UM-SCC47,CaSki,SiHa細(xì)胞中HPV-16長調(diào)控區(qū)(LCR)的甲基化類型；檢測與HPV感染關(guān)系最為密切的口咽鱗癌(OPSCC)組織標(biāo)本中HPV-16 LCR內(nèi)的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。研究方法：提取HPV-16陽性腫瘤細(xì)胞UM-SCC47, CaSki, SiHa細(xì)胞的DNA,提取本課題第一章檢測以及本實(shí)驗(yàn)室前期檢測的HPV-16陽性O(shè)PSCC組織標(biāo)本的DNA,共19例。所有標(biāo)本均經(jīng)測序證實(shí)為HPV-16感染,且無其他型別HPV重疊感染。所有口咽鱗癌標(biāo)本均來源于扁桃體,舌根,大多數(shù)病例處于臨床晚期,其中Ⅰ期0例,Ⅱ期1例,Ⅲ期1例,ⅣA期17例,ⅣC期1例；標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)分化分類,其中低分化6例,中分化10例,高分化3例。對(duì)納入研究的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾(Bisulfite modification)。然后,LCR分為5'-LCR區(qū),Enhancer區(qū)和Promoter區(qū)3個(gè)片段,分別使用亞硫酸氫鹽測序PCR(bisulfite-sequencing PCR, BSP)特異性引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增,純化BSP產(chǎn)物,然后進(jìn)行TA克隆,將細(xì)菌接種到培養(yǎng)板上培養(yǎng),挑取至少6個(gè)或8個(gè)單克隆菌斑(細(xì)胞：8個(gè)克隆,組織標(biāo)本：6個(gè)克隆),培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行測序,每個(gè)BSP片段產(chǎn)物克隆后均測序6次或8次(細(xì)胞：8次,組織標(biāo)本：6次)。分析測序序列,獲得甲基化的CpG (methylated CpG, meCpG)克隆出現(xiàn)的頻率,計(jì)算每個(gè)CpG位點(diǎn)和LCR總體上的甲基化率。結(jié)果：①分析測序序列,顯示亞硫酸氫鹽修飾徹底,通過測序可以獲得每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況。CaSki細(xì)胞、SiHa細(xì)胞和OPSCC標(biāo)本的LCR區(qū)均有15個(gè)CpG位點(diǎn),而UM-SCC47細(xì)胞的LCR區(qū)由于在nt7435和nt31處發(fā)生堿基變異,影響了該處CpG位點(diǎn)的存在,所以目標(biāo)區(qū)域內(nèi)共有13個(gè)CpG位點(diǎn)。②UM-SCC47和CaSki細(xì)胞的HPV-16 LCR均為高甲基化狀態(tài),整體甲基化率分別為79.8%(83/104)和90.0%(108/120),SiHa細(xì)胞則為完全非甲基化(0/120)。19例OPSCC標(biāo)本的LCR區(qū)內(nèi)CpG位點(diǎn)的平均甲基化率為13.1%(194/1481),總體上LCR區(qū)的甲基化可分為3種類型：高甲基化型(甲基化率≥30%),低甲基化型(5%-30%)和非甲基化型(甲基化率5%)。③在UM-SCC47細(xì)胞和CaSki細(xì)胞中5'-LCR的CpG位點(diǎn)的甲基化率均高于Enhancer-Promoter區(qū)的甲基化率,分別為(91.7% vs.76.3%)和(100% vs.86.4%),由于進(jìn)行測序的克隆數(shù)量的限制,差異均未達(dá)到顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.147,P=0.063)。OPSCC標(biāo)本中5'-LCR和Promoter區(qū)的甲基化率分別為14.6%(58/396)和16.5% (95/577),均高于Enhancer區(qū)的甲基化率8.1% (41/508),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.002,P0.001)。④M-SCC47細(xì)胞、CaSki細(xì)胞和OPSCC標(biāo)本中,位于nt7862的CpG位點(diǎn)均呈現(xiàn)顯著的低甲基化狀態(tài)。在UM-SCC47和CaSki細(xì)胞內(nèi),除外位于E2BS-2內(nèi)的CpG位點(diǎn)(nt7862),位于其他E2BSs內(nèi)的CpG位點(diǎn)與位于E2BSs外的CpG位點(diǎn)相比均具有較高的甲基化率,分別為(97.9% vs.68.8%)和(100% vs.91.1%),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,P=0.060),在OPSCC標(biāo)本中也有類似的結(jié)果(17.5% vs.11.2%),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。結(jié)論：HPV-16陽性腫瘤細(xì)胞中,在LCR區(qū)有兩種以上的甲基化類型；OPSCC組織標(biāo)本中,LCR區(qū)的平均甲基化率較低,但整體上仍存在明顯不同的甲基化類型。第三章HPV-16 LCR內(nèi)meCpG位點(diǎn)的去甲基化對(duì)HPV陽性頭頸腫瘤細(xì)胞的影響研究目的：研究去甲基化藥物處理HPV-16陽性口咽鱗癌UM-SCC47細(xì)胞后,細(xì)胞的生物學(xué)特征以及癌基因E6和E7的變化；分析不同HPV-16陽性腫瘤細(xì)胞對(duì)逆轉(zhuǎn)LCR區(qū)meCpG甲基化的不同生物學(xué)特性變化,探討不同HPV-16陽性腫瘤細(xì)胞中可能不同的致癌機(jī)制,以及去甲基化作為HPV陽性細(xì)胞的治療手段的可行性。研究方法：①采用BSP和甲基化特異性PCR (Methylation-specific PCR, MSP)兩步擴(kuò)增法來評(píng)估HPV-16 LCR區(qū)的總體甲基化狀態(tài)；采用BSP法測定給予5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dc)處理后,3種HPV-16陽性腫瘤細(xì)胞LCR區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)變化；②提取細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；分別采用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量法(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)擴(kuò)增GAPDH (或β-actin), E6和E7,分析HPV-16 E6 和 E7 mRNA的表達(dá)。qRT-PCR采用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法,不同標(biāo)本間的E6和E7的相對(duì)表達(dá)量采用E6/β-actin和E7/β-act in進(jìn)行比較；③采用細(xì)胞免疫組化檢測HPV-16陽性細(xì)胞E6和E7的蛋白表達(dá);④測定5-aza-dc對(duì)細(xì)胞生長的影響,采用MTS四唑化合物和臺(tái)盼藍(lán)溶液測定細(xì)胞增殖抑制情況；⑤用Annexin-V/7-AAD對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,根據(jù)染色情況得出細(xì)胞凋亡率；用碘化丙啶(PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,檢測細(xì)胞周期阻滯；⑥采用Lipofectamine RNAiMax轉(zhuǎn)染siRNA沉默細(xì)胞的E6和E7表達(dá),然后再測定細(xì)胞生物學(xué)特性的變化,包括細(xì)胞增殖抑制,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期變化。結(jié)果：①采用MSP兩步擴(kuò)增法和BSP擴(kuò)增后TA克隆測序所得的LCR區(qū)去甲基化的結(jié)果一致,即0.5μM 5-aza-dc處理細(xì)胞96小時(shí)的去甲基化效果最好。②0.5μM 5-aza-dc處理UM-SCC47和CaSki細(xì)胞96小時(shí)后,LCR區(qū)內(nèi)meCpG位點(diǎn)的甲基率分別降至19.2%(20/104)和29.2%(35/120),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,P0.001)；而SiHa細(xì)胞的CpG位點(diǎn)仍保持完全非甲基化狀態(tài)(0%,0/120)。③5-aza-d c去甲基化處理明顯降低了UM-SCC47細(xì)胞和CaSki細(xì)胞E6和E7 mRNA表達(dá),UM-SCC47細(xì)胞的變化(P=0.034,P=0.008)和CaSki細(xì)胞的變化(P=0.017,P=0.023)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是SiHa細(xì)胞無明顯改變。采用細(xì)胞免疫組化測定UM-SCC47細(xì)胞和CaSki細(xì)胞內(nèi)E6和E7蛋白表達(dá)及分布情況,結(jié)果與DMSO處理組相比,E6和E7染色強(qiáng)度以及范圍明顯減少。④5-aza-dc處理可以明顯影響細(xì)胞的生長,抑制細(xì)胞增殖。UM-SCC47細(xì)胞和CaSki細(xì)胞的凋亡細(xì)胞均增多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026,P=0.001),阻滯在S期的細(xì)胞增多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048,P=0.003),阻滯在G2/M期的細(xì)胞增多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002,P=0.044)。而5-aza-dc處理SiHa細(xì)胞后,細(xì)胞生長也受抑制,細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑤為驗(yàn)證去甲基化后細(xì)胞的生物學(xué)變化是否與E6和E7的表達(dá)下降相關(guān),轉(zhuǎn)染siRNA沉默UM-SCC47、CaSki和SiHa細(xì)胞的E6和E7表達(dá)后,均導(dǎo)致3種細(xì)胞均出現(xiàn)生長抑制,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044,P=0.006,P=0.022),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026,P=0.036,P=0.016),導(dǎo)致阻滯于G2/M期的細(xì)胞增多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027,P=0.035,P=0.012)。說明LCR的去甲基化而引起的細(xì)胞生物學(xué)特性變化與E6和E7的表達(dá)下降有關(guān)。此外,5-aza-dc還可以導(dǎo)致UM-SCC47, CaSki細(xì)胞的S期阻滯以及SiHa細(xì)胞的生長抑制,考慮與藥物的S-期阻滯特性以及細(xì)胞毒性有關(guān)。結(jié)論：LCR區(qū)甲基化狀態(tài)不同的2種HPV-16陽性腫瘤細(xì)胞對(duì)去甲基化處理表現(xiàn)出完全不同的反應(yīng),提示在HPV-16陽性腫瘤中,可能存在與LCR區(qū)甲基化狀態(tài)相關(guān)的不同的腫瘤特性及致癌機(jī)制。此外,逆轉(zhuǎn)LCR區(qū)內(nèi)的meCpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài),有可能作為治療部分HPV陽性腫瘤患者的一種新療法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.91
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本文編號(hào)：1699999