本文選題：人乳頭瘤病毒　切入點：長調控區(qū)　出處：《南方醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：頭頸部惡性腫瘤(head and neck squamous cell carcinoma, HNS CC)是常見的惡性腫瘤,主要包括口咽癌、喉癌、下咽癌、口腔癌、鼻咽癌等。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)已被證實具有致癌性,持續(xù)感染高危型HPV-16/18是除過度吸煙和飲酒外的另一個被確認的頭頸鱗癌發(fā)病的獨立危險因素。頭頸鱗癌中約20%-30%的患者發(fā)病與感染HPV相關,世界范圍內約70%的口咽鱗癌內檢測到HPV感染。流行病學發(fā)現(xiàn)無煙酒嗜好的頭頸鱗癌患者,尤其是年輕患者較前增多,HPV感染與部分頭頸鱗癌的關系已越來越被重視。近年國外較多的流行病學研究報道了HPV在頭頸腫瘤中的感染率,其因地區(qū)、種族、生活習慣等而有差別,而不同的檢測方法,標本收集時間也可導致HPV感染率出現(xiàn)較大的差別。研究一個地區(qū)內頭頸腫瘤中的HPV感染率有利于該地區(qū)的腫瘤的防治；此外,準確地篩選出HPV陽性頭頸腫瘤標本,也是后續(xù)研究HPV相關頭頸腫瘤的致癌機制、分子標記物等的必需過程。本課題中,我們采用高敏感度PCR擴增的方法,使用新鮮冰凍標本,檢測HPV在頭頸病變中的感染率,并進一步分析HPV陽性頭頸部病變患者的臨床特征。喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,其中鱗狀細胞癌占96%-98%。世界范圍內,喉癌患者中HPV的感染率波動很大,處于3%-60%之間。現(xiàn)有研究提示中國喉癌患者中可能有較高的HPV感染率,中國喉癌患者與HPV感染的相關性可能更加緊密；例如,近期一篇薈萃分析報道世界范圍內高危型HPV的感染率為26.6%,其中納入了3篇來自中國人群的研究文獻,其感染率分別是58.8%,36.4%和41.67%,均高于歐美的平均感染率。但是,現(xiàn)有的關于中國喉癌中HPV感染率的研究報道明顯少于歐美國家以及日本,并且各項研究在樣本量、標本保存方法、檢測手段、HPV分型等方面并不統(tǒng)一,所報道的HPV感染率也差別較大。此外,盡管有些研究發(fā)現(xiàn)喉癌中HPV感染率較高,但HPV感染與喉癌發(fā)病的相關性尚存在爭議。為了評估中國喉癌患者整體中的HPV感染率,并進一步評價HPV感染與喉癌發(fā)生的相關性,本課題進行了中國喉癌患者中HPV感染率的薈萃分析,并進一步分析探討HPV感染與喉癌的相關性。HPV-16基因包含編碼早期蛋白(E1,E2,E4,E5,E6,E7),晚期蛋白(L1,L2)和一個非編碼調控區(qū)基因。其中,長調控區(qū)(long control region, LCR)是HPV維持病毒復制周期的重要的調控結構,其序列包含病毒轉錄的增強子,促進子和復制起點,以及包含E2結合位點(E2 binding site, E2BS)在內的多種調節(jié)元件的結合位點。E6和E7是HPV-16主要的癌基因,E6和E7蛋白可以分別與腫瘤抑癌蛋白p53和pRb結合,并使其降解而發(fā)揮致癌作用以及維持腫瘤細胞的惡性轉化。E2是HPV病毒重要的調節(jié)基因,E2蛋白可以通過與位于LCR區(qū)的4個E2BS位點(E2BS-1, E2BS-2, E2BS-3, E2BS-4)結合,從而發(fā)揮調節(jié)病毒復制的作用,并且可以抑制E6和E7癌蛋白的過度表達。DNA甲基化修飾(DNA methylation modification)是表觀遺傳學修飾(epigenetic)的一種重要表現(xiàn)形式,亦是在轉錄水平調控基因表達的一種重要方式。抑癌基因啟動子的CpG位點的甲基化是導致抑癌基因轉錄失活的重要原因之一,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。新近有研究發(fā)現(xiàn),與HPV陰性腫瘤細胞相比,HPV陽性腫瘤細胞的基因的整體甲基化水平更高；HPV-DNA進入宿主細胞后也往往發(fā)生甲基化,宮頸癌中HPV-16 LCR的甲基化水平與宮頸腫瘤的嚴重性密切相關,說明HPV-DNA的甲基化與腫瘤的病變進展密切相關。由于LCR是HPV病毒中重要的調控結構,LCR區(qū)E2BS內的CpG位點的高甲基化可以影響E2蛋白結合到E2BS,從而影響發(fā)揮對癌基因E6和E7的表達抑制。所以,LCR區(qū)的甲基化與HPV陽性腫瘤的發(fā)生、進展、預后都密切相關。頭頸部鱗癌與宮頸癌二者在發(fā)生發(fā)展、腫瘤的生物學特性、治療及預后等各方面均有較大差別。然而,即使是在宮頸癌中,關于HPV-16 LCR區(qū)甲基化狀態(tài)的研究亦有較多不一致的結果。在現(xiàn)有研究中,頭頸鱗癌中HPV-16 LCR的甲基化狀態(tài)的研究結果相當有限。在頭頸鱗癌中,CPSCC (oropharygeal squamous cell carcinoma, OPSCC)與HPV感染的關系最為密切。檢測HPV-16陽性的OPSCC標本中LCR區(qū)CpG位點的甲基化狀態(tài),尤其是LCR區(qū)E2BS位點的甲基化狀態(tài),有助于研究HPV基因的甲基化在癌變過程中的作用,檢測LCR內的CpG位點的甲基化分布特征,可以進一步分析其與腫瘤的臨床特征的關系。此外,迄今為止,尚無研究報道HPV陽性頭頸鱗癌細胞中LCR內的CpG位點的甲基化狀態(tài),而檢測不同HPV-16陽性腫瘤細胞中的LCR區(qū)甲基化狀態(tài),有利于建立各種研究HPV基因甲基化的實驗模型,并進一步探討病毒基因甲基化狀態(tài)的對腫瘤的影響以及治療等。癌基因E6和E7的轉錄主要受E2蛋白調節(jié)控制,E2蛋白通過與位于Promoter區(qū)內的E2BS-3和E2BS-4結合而發(fā)揮作用；此外,NF-1, AP1, Tef等多種調控原件也通過與位于Enhancer區(qū)內的受體結合參與到調節(jié)E6和E7轉錄的調節(jié)中。甲基化的CpG (meCpG)位點往往導致基因功能上的改變,由于CpG位點的甲基化是一個可逆的過程,所以通過去甲基化試劑逆轉HPV陽性腫瘤細胞的LCR區(qū)內的meCpG位點的高甲基化狀態(tài),可以恢復LCR的調節(jié)功能,這不僅有助于研究LCR區(qū)的甲基化在維持腫瘤細胞的生長增殖等腫瘤特性中的作用,并有可能成為HPV陽性頭頸腫瘤一個有效的治療措施。CaSki, SiHa細胞株是最常用的HPV-16陽性宮頸癌細胞株,近年來,有學者嘗試使用去甲基化試劑逆轉上述細胞中HPV-LCR內meCpG位點的甲基化,從而研究甲基化狀態(tài)對腫瘤細胞的影響,然而不同的細胞株之間,甚至使用相同細胞株的不同研究的實驗結果并不完全一致�，F(xiàn)有研究提示,逆轉LCR區(qū)內的meCpG位點,不同的HPV陽性宮頸癌細胞,在生長、形態(tài)特性以及癌基因E6,E7的表達上可能不同,這可能與LCR區(qū)的甲基化狀態(tài)有關。然而,HPV陽性頭頸鱗癌細胞株較難建立,并且現(xiàn)有的絕大多數(shù)HPV陽性細胞株仍未商業(yè)化,至今尚無研究報道HPV陽性頭頸鱗癌細胞的LCR區(qū)的甲基化狀態(tài)以及細胞對去甲基化試劑的反應。本課題使用HPV-16陽性口咽鱗癌細胞株UM-SCC47,在給予去甲基化試劑處理逆轉meCpG位點的甲基化狀態(tài)后,研究UM-SCC47細胞的生物學特征以及癌基因E6和E7的變化,來探討HPV-16LCR甲基化狀態(tài)對HPV陽性頭頸腫瘤細胞的影響,并通過比較HPV陽性細胞不同的甲基化狀態(tài)對去甲基化處理的不同反應,探討HPV基因的甲基化的致癌機理。此外,本研究還探討逆轉LCR區(qū)meCpG甲基化作為HPV陽性細胞的治療措施的可行性。第一章頭頸腫瘤中HPV感染的流行病學分析第1部分頭頸部病變中HPV的檢測及臨床特征分析研究目的：檢測頭頸部病變組織中的HPV-DNA,分析HPV在頭頸部病變中的感染情況,并分析HPV陽性頭頸腫瘤的臨床特性。研究方法：收集自2013年7月至2014年4月于日本琉球大學耳鼻喉科門診或病房治療的頭頸部病變患者的組織標本,共180例,包括頭頸腫瘤163例,非腫瘤良性病變包括炎癥以及非典型增生等14例,喉乳頭狀瘤3例。頭頸腫瘤標本中包括頭頸鱗癌83例,咽喉部腺瘤5例,頭頸部淋巴瘤16例,原發(fā)不明癌7例,腮腺腫瘤29例,頜下腺腫瘤4例,外耳腫瘤8例。所有標本活檢離體后立即儲存于液氮中。提取上述組織標本的DNA,并評估DNA質量。使用兩對HPV共通型引物GP5+/GP6+和MY09/MY11進行巢式PCR擴增檢測HPV-DNA,分別選用HPV-16陽性細胞CaSki和HPV陰性細胞HN041的DNA作為陽性對照和陰性對照。所有PCR陽性的擴增產(chǎn)物均需測序確定為HPV序列,并且與現(xiàn)有HPV亞型的序列比對,確定HPV亞型。結果：喉乳頭瘤組織中HPV感染率最高,達到100%(3/3),均為低危型HPV-6感染。頭頸鱗癌標本中,HPV平均感染率為22.9%(19/64),且均為高危型HPV-16感染,其中口咽癌患者感染率最高,達到36.0%(9/25),下咽癌的感染率為21.7%(5/23),鼻咽癌的感染率為20.0%(1/5),口腔癌的感染為17.4%(4/23),但是7例喉鱗癌組織中均未檢測到HPV感染。此外,咽喉部腺癌(5例)、咽喉部良性病變(14例)、頭頸部淋巴瘤(16例)組織中均各有1例檢測到HPV-16 DNA；而甲狀腺腫瘤(11例),腮腺腫瘤(29例),頜下腺腫瘤(4例),外耳道腫瘤(8例)以及原發(fā)不明癌(7例)組織中均未檢測到HPV感染。經(jīng)分析,HPV陽性頭頸鱗癌患者的T分期較早,有統(tǒng)計學意義(P=0.034)；HPV陽性頭頸鱗癌患者中低年齡段患者(≤55歲)比例高于HPV陰性頭頸鱗癌患者,差異處于有統(tǒng)計學意義的臨界值(P=0.074)。結論：喉乳頭狀瘤與HPV-6感染有明確相關性；部分頭頸鱗癌與HPV感染相關,其中口咽癌最為密切,而喉癌與HPV感染關系尚不能確定；腮腺和甲狀腺腫瘤與HPV感染無明顯相關。第2部分中國喉癌中HPV感染率及HPV感染與喉癌相關性的薈萃分析研究目的：研究中國喉癌患者群體的高危型HPV-16/18感染率,并評估HPV-16/18感染與喉癌發(fā)病的相關性。研究方法：檢索各種常用中英文數(shù)據(jù)庫,按照預先制定的方案篩選相關文獻,共納入22篇符合納入標準的文獻。根據(jù)研究開始前制定的方案提取相關數(shù)據(jù)。使用R3.0軟件進行薈萃分析,分析喉癌患者中HPV-16/18的陽性率。進一步篩選病例-對照研究,共12篇文獻符合納入標準,提取相關數(shù)據(jù),進行薈萃分析評估HPV-16/18感染與喉癌發(fā)病的相關性。結果：喉癌患者中HPV-16/18陽性率的薈萃分析中,共提取到1477例喉癌病例,感染率為30.1%(95%CI：24.2%-36.8%)。評估高危型HPV-16/18感染的風險效應的薈萃分析中,一共提取到1040例喉癌病例和735例對照病例,喉癌組及對照組感染率分別為31.1%和5.0%,OR為8.07(95%CI：5.67-11.48),有統(tǒng)計學差異(P0.001)。結論：中國喉癌患者群體中有較高的HPV-16/18感染率；HPV-16/18的感染明顯增加了中國人群中喉癌的發(fā)病風險。第二章HPV-16陽性腫瘤細胞和口咽鱗癌中HPV-16長調控區(qū)的甲基化狀態(tài)分析研究目的:檢測HPV-16陽性腫瘤細胞株UM-SCC47,CaSki,SiHa細胞中HPV-16長調控區(qū)(LCR)的甲基化類型；檢測與HPV感染關系最為密切的口咽鱗癌(OPSCC)組織標本中HPV-16 LCR內的CpG位點的甲基化狀態(tài)。研究方法：提取HPV-16陽性腫瘤細胞UM-SCC47, CaSki, SiHa細胞的DNA,提取本課題第一章檢測以及本實驗室前期檢測的HPV-16陽性OPSCC組織標本的DNA,共19例。所有標本均經(jīng)測序證實為HPV-16感染,且無其他型別HPV重疊感染。所有口咽鱗癌標本均來源于扁桃體,舌根,大多數(shù)病例處于臨床晚期,其中Ⅰ期0例,Ⅱ期1例,Ⅲ期1例,ⅣA期17例,ⅣC期1例；標本進行組織學分化分類,其中低分化6例,中分化10例,高分化3例。對納入研究的DNA進行亞硫酸氫鹽修飾(Bisulfite modification)。然后,LCR分為5'-LCR區(qū),Enhancer區(qū)和Promoter區(qū)3個片段,分別使用亞硫酸氫鹽測序PCR(bisulfite-sequencing PCR, BSP)特異性引物對進行擴增,純化BSP產(chǎn)物,然后進行TA克隆,將細菌接種到培養(yǎng)板上培養(yǎng),挑取至少6個或8個單克隆菌斑(細胞：8個克隆,組織標本：6個克隆),培養(yǎng)后提取質粒DNA分別進行測序,每個BSP片段產(chǎn)物克隆后均測序6次或8次(細胞：8次,組織標本：6次)。分析測序序列,獲得甲基化的CpG (methylated CpG, meCpG)克隆出現(xiàn)的頻率,計算每個CpG位點和LCR總體上的甲基化率。結果：①分析測序序列,顯示亞硫酸氫鹽修飾徹底,通過測序可以獲得每個CpG位點的甲基化情況。CaSki細胞、SiHa細胞和OPSCC標本的LCR區(qū)均有15個CpG位點,而UM-SCC47細胞的LCR區(qū)由于在nt7435和nt31處發(fā)生堿基變異,影響了該處CpG位點的存在,所以目標區(qū)域內共有13個CpG位點。②UM-SCC47和CaSki細胞的HPV-16 LCR均為高甲基化狀態(tài),整體甲基化率分別為79.8%(83/104)和90.0%(108/120),SiHa細胞則為完全非甲基化(0/120)。19例OPSCC標本的LCR區(qū)內CpG位點的平均甲基化率為13.1%(194/1481),總體上LCR區(qū)的甲基化可分為3種類型：高甲基化型(甲基化率≥30%),低甲基化型(5%-30%)和非甲基化型(甲基化率5%)。③在UM-SCC47細胞和CaSki細胞中5'-LCR的CpG位點的甲基化率均高于Enhancer-Promoter區(qū)的甲基化率,分別為(91.7% vs.76.3%)和(100% vs.86.4%),由于進行測序的克隆數(shù)量的限制,差異均未達到顯著統(tǒng)計學差異(P=0.147,P=0.063)。OPSCC標本中5'-LCR和Promoter區(qū)的甲基化率分別為14.6%(58/396)和16.5% (95/577),均高于Enhancer區(qū)的甲基化率8.1% (41/508),具有統(tǒng)計學差異(P=0.002,P0.001)。④M-SCC47細胞、CaSki細胞和OPSCC標本中,位于nt7862的CpG位點均呈現(xiàn)顯著的低甲基化狀態(tài)。在UM-SCC47和CaSki細胞內,除外位于E2BS-2內的CpG位點(nt7862),位于其他E2BSs內的CpG位點與位于E2BSs外的CpG位點相比均具有較高的甲基化率,分別為(97.9% vs.68.8%)和(100% vs.91.1%),均具有統(tǒng)計學意義(P0.001,P=0.060),在OPSCC標本中也有類似的結果(17.5% vs.11.2%),有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。結論：HPV-16陽性腫瘤細胞中,在LCR區(qū)有兩種以上的甲基化類型；OPSCC組織標本中,LCR區(qū)的平均甲基化率較低,但整體上仍存在明顯不同的甲基化類型。第三章HPV-16 LCR內meCpG位點的去甲基化對HPV陽性頭頸腫瘤細胞的影響研究目的：研究去甲基化藥物處理HPV-16陽性口咽鱗癌UM-SCC47細胞后,細胞的生物學特征以及癌基因E6和E7的變化；分析不同HPV-16陽性腫瘤細胞對逆轉LCR區(qū)meCpG甲基化的不同生物學特性變化,探討不同HPV-16陽性腫瘤細胞中可能不同的致癌機制,以及去甲基化作為HPV陽性細胞的治療手段的可行性。研究方法：①采用BSP和甲基化特異性PCR (Methylation-specific PCR, MSP)兩步擴增法來評估HPV-16 LCR區(qū)的總體甲基化狀態(tài)；采用BSP法測定給予5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dc)處理后,3種HPV-16陽性腫瘤細胞LCR區(qū)CpG位點的甲基化狀態(tài)變化；②提取細胞的總RNA,逆轉錄成cDNA；分別采用RT-PCR和實時熒光定量法(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)擴增GAPDH (或β-actin), E6和E7,分析HPV-16 E6 和 E7 mRNA的表達。qRT-PCR采用標準曲線相對定量法,不同標本間的E6和E7的相對表達量采用E6/β-actin和E7/β-act in進行比較；③采用細胞免疫組化檢測HPV-16陽性細胞E6和E7的蛋白表達;④測定5-aza-dc對細胞生長的影響,采用MTS四唑化合物和臺盼藍溶液測定細胞增殖抑制情況；⑤用Annexin-V/7-AAD對細胞進行染色,根據(jù)染色情況得出細胞凋亡率；用碘化丙啶(PI)對細胞進行染色,檢測細胞周期阻滯；⑥采用Lipofectamine RNAiMax轉染siRNA沉默細胞的E6和E7表達,然后再測定細胞生物學特性的變化,包括細胞增殖抑制,細胞凋亡,細胞周期變化。結果：①采用MSP兩步擴增法和BSP擴增后TA克隆測序所得的LCR區(qū)去甲基化的結果一致,即0.5μM 5-aza-dc處理細胞96小時的去甲基化效果最好。②0.5μM 5-aza-dc處理UM-SCC47和CaSki細胞96小時后,LCR區(qū)內meCpG位點的甲基率分別降至19.2%(20/104)和29.2%(35/120),差異有統(tǒng)計學意義(P0.001,P0.001)；而SiHa細胞的CpG位點仍保持完全非甲基化狀態(tài)(0%,0/120)。③5-aza-d c去甲基化處理明顯降低了UM-SCC47細胞和CaSki細胞E6和E7 mRNA表達,UM-SCC47細胞的變化(P=0.034,P=0.008)和CaSki細胞的變化(P=0.017,P=0.023)均具有統(tǒng)計學意義,但是SiHa細胞無明顯改變。采用細胞免疫組化測定UM-SCC47細胞和CaSki細胞內E6和E7蛋白表達及分布情況,結果與DMSO處理組相比,E6和E7染色強度以及范圍明顯減少。④5-aza-dc處理可以明顯影響細胞的生長,抑制細胞增殖。UM-SCC47細胞和CaSki細胞的凋亡細胞均增多,有統(tǒng)計學意義(P=0.026,P=0.001),阻滯在S期的細胞增多,有統(tǒng)計學意義(P=0.048,P=0.003),阻滯在G2/M期的細胞增多,有統(tǒng)計學意義(P=0.002,P=0.044)。而5-aza-dc處理SiHa細胞后,細胞生長也受抑制,細胞凋亡、細胞周期阻滯的變化無統(tǒng)計學差異。⑤為驗證去甲基化后細胞的生物學變化是否與E6和E7的表達下降相關,轉染siRNA沉默UM-SCC47、CaSki和SiHa細胞的E6和E7表達后,均導致3種細胞均出現(xiàn)生長抑制,有統(tǒng)計學意義(P=0.044,P=0.006,P=0.022),誘導細胞凋亡增多,有統(tǒng)計學意義(P=0.026,P=0.036,P=0.016),導致阻滯于G2/M期的細胞增多,有統(tǒng)計學意義(P=0.027,P=0.035,P=0.012)。說明LCR的去甲基化而引起的細胞生物學特性變化與E6和E7的表達下降有關。此外,5-aza-dc還可以導致UM-SCC47, CaSki細胞的S期阻滯以及SiHa細胞的生長抑制,考慮與藥物的S-期阻滯特性以及細胞毒性有關。結論：LCR區(qū)甲基化狀態(tài)不同的2種HPV-16陽性腫瘤細胞對去甲基化處理表現(xiàn)出完全不同的反應,提示在HPV-16陽性腫瘤中,可能存在與LCR區(qū)甲基化狀態(tài)相關的不同的腫瘤特性及致癌機制。此外,逆轉LCR區(qū)內的meCpG位點甲基化狀態(tài),有可能作為治療部分HPV陽性腫瘤患者的一種新療法。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.91
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本文編號：1699999