本文選題：白藜蘆醇　切入點(diǎn)：糖尿病腎病　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景與研究目的糖尿病腎病(DN)作為糖尿病的微血管并發(fā)癥之一是導(dǎo)致終末期腎臟病(ESRD)的一個(gè)主要病因。許多致病因素造成DN的發(fā)生與發(fā)展。腎小球損傷,尤其是系膜細(xì)胞增生以及腎小球內(nèi)高壓是DN的主要病理特點(diǎn),然而許多臨床研究和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物研究表明腎小管上皮細(xì)胞損傷與腎功能降低有密切關(guān)系,并作為評估DN預(yù)后的指標(biāo)之一。因此探究腎小管上皮細(xì)胞損傷在DN發(fā)病機(jī)制中的作用并尋找可早期防治的藥物是十分必要的。氧化應(yīng)激是指自由基的產(chǎn)生和抗氧化物質(zhì)抵御之間的不平衡,從而導(dǎo)致組織損傷。很多研究表明氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制過程中有非常重要的作用。近年來,關(guān)于叉頭框蛋白 O3a(FOX03a)在腎臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用受到廣泛關(guān)注。FOX03a是叉頭框蛋白(FOXO)家族中的一員,在老化,細(xì)胞代謝,胰島素抵抗和抑制氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。已有研究證實(shí)FOX03a可以調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氯酶(CAT)等抗氧化物質(zhì)。許多研究表明FOX03a在急性腎損傷、DN等多種腎臟疾病中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞死亡的一種方式,參與腎臟生理學(xué)重塑,使腎臟細(xì)胞減少,結(jié)構(gòu)改變。糖尿病病人和鏈脲佐霉素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中都表現(xiàn)出近端腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。P53是一種腫瘤抑制基因,研究表明包括DN在內(nèi)的多種腎臟病中P53的表達(dá)是增高的。P53可以增加足細(xì)胞,系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的凋亡,從而導(dǎo)致腎臟損傷。沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sir2)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的脫乙�；�,目前哺乳類動(dòng)物Sir2中發(fā)現(xiàn)7種沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRTs),目前為止SIRT1被認(rèn)為是與人類Sir2直接同源并且是研究最多的Sir2。SIRT1可以通過其脫乙�；钚哉{(diào)節(jié)多條信號通路,SIRT1不僅可以脫乙酰化組蛋白并且可以脫乙�；墙M蛋白,比如 FOXO、P53、NF-κB、PGC-1a、PARP、Ku70 等。SIRT1在凋亡反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。有研究表明SIRT1通過與FOXO3a直接結(jié)合并脫乙�；疐OXO3a,調(diào)節(jié)FOX03a的轉(zhuǎn)錄活性,降低氧化應(yīng)激損傷。然而,SIRT1/FOX03a在高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激方面的作用目前研究較少。許多研究還發(fā)現(xiàn)SIRT1通過去乙酰化P53蛋白第382位的賴氨酸殘基來抑制P53的活性,從而降低P53對其下游靶基因的激活作用,減少細(xì)胞凋亡。故在防治DN發(fā)生和發(fā)展的進(jìn)程中SIRT1可以作為新的作用靶點(diǎn)。白藜蘆醇(RSV)作為SIRT1激動(dòng)劑被人們熟知,是一種天然的多元酚類物質(zhì),在葡萄皮中含量豐富,具有廣泛的生物學(xué)活性和藥理作用,如抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗癌、心血管保護(hù)作用等,為許多疾病提供了有效的治療方法。但是RSV抑制或延緩糖尿病相關(guān)的腎小管氧化應(yīng)激和凋亡的具體機(jī)制并不明確。據(jù)上所述,我們提出以下假說:高糖可以導(dǎo)致SIRT1的表達(dá)降低,在糖尿病大鼠腎臟中,SIRT1的減少可以通過增加乙�；疐OXO3a和乙�；疨53的表達(dá)水平而引發(fā)一系列氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng),而白藜蘆醇治療可以通過增加SIRT1表達(dá)及其脫乙酰化活性而抑制乙�；疐OXO3a和乙酰化P53的表達(dá)水平,從而抑制由高糖引發(fā)的氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng)。為驗(yàn)證以上假說,我們將首先檢測糖尿病大鼠腎臟中的SIRT1及其脫乙酰化活性、FOXO3a及乙酰化FOXO3a蛋白表達(dá)水平、P53及乙酰化P53蛋白表達(dá)水平、各氧化應(yīng)激因子和凋亡因子的變化,然后利用體外高糖刺激的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)尋找上述指標(biāo)變化的機(jī)制。研究方法我們分別用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)研究白藜蘆醇對糖尿病大鼠腎組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制。采用STZ(60 mg/kg)誘導(dǎo)的大鼠作為糖尿病動(dòng)物模型,動(dòng)物隨機(jī)分為三組:正常對照組,糖尿病組,糖尿病+白藜蘆醇組(30 mg·kg-1·d-1)。治療16周后,留尿、稱重、抽血、取腎用于后續(xù)分析;HK-2細(xì)胞給予白藜蘆醇(25 μM)預(yù)刺激2 h后,加入高糖(30 mM)刺激72 h。為了進(jìn)一步研究SIRT1在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用,我們采用了S1RT1 siRNA或CON siRNA轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中,利用western b1ot和RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染效率后,將轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)在高糖環(huán)境中加入或不加入白藜蘆醇(25 μM)培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)室方法檢測大鼠腎重/體重、空腹血糖和內(nèi)生肌酐清除率;大鼠腎臟糖原沉積及纖維化情況采用PAS、masson染色評估;免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠腎臟中SIRT1的表達(dá);特異的檢測試劑盒檢測大鼠腎臟組織及HK-2細(xì)胞中的SIRT1脫乙酰化活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;western blot方法檢測大鼠腎臟組織和HK-2細(xì)胞中SIRT1、FOXO3a、過氧化氫酶(CAT)的蛋白表達(dá);免疫共沉淀反應(yīng)檢測大鼠腎臟組織及HK-2細(xì)胞乙�；疐OX03a的蛋白表達(dá)。為明確白藜蘆醇對糖尿病大鼠腎組織凋亡反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制,糖尿病大鼠成模采用一次性腹腔內(nèi)注射STZ(60 mg/kg),動(dòng)物隨機(jī)分為三組:正常對照組,糖尿病組,糖尿病+白藜蘆醇組(30 mg · kg-1 · d1)。治療16周后,稱重、抽血、取腎用于后續(xù)分析:HK-2細(xì)胞分別給予高糖刺激0h,24h,48h,72 h檢測高糖誘導(dǎo)時(shí)間對凋亡的影響。白藜蘆醇(25 μM)預(yù)刺激2h后,給予高糖(30 mM)刺激72 h,驗(yàn)證白藜蘆醇對高糖誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)的影響。為了進(jìn)一步研究SIRT1在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡中的作用,我們采用了 SIRT1 siRNA或CON siRNA轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中,利用western blot和RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染效率后,將轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)在高糖環(huán)境中加入或不加入白藜蘆醇(25 μM)培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)室方法檢測大鼠腎重/體重、空腹血糖、血肌酐和尿素氮;大鼠腎臟糖原沉積及纖維化情況采用PAS、masson染色評估;免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠腎臟中SIRT1的表達(dá);特異性試劑盒檢測SIR1脫乙酰化活性、caspase-3活性、caspase-9活性;JC-1染色檢測線粒體膜電位梯度;Hoecst33258染色檢測細(xì)胞核形態(tài);western blot方法檢測大鼠腎臟組織和 HK-2 細(xì)胞中 cleaved caspase-3、cleaved PARP、SIRT1、P53 和乙酰化 P53 的蛋白表達(dá)。研究結(jié)果1.白藜蘆醇通過增加SIRT1脫乙酰化FOXO3a改善糖尿病大鼠腎臟的氧化應(yīng)激1.1白藜蘆醇改善糖尿病大鼠代謝指標(biāo)及腎臟纖維化等病理異常與糖尿病(DM)組相比,白藜蘆醇治療后空腹血糖無明顯改善,腎重/體重顯著降低,肌酐清除率顯著上升,白藜蘆醇治療組大鼠腎臟糖原沉積明顯減少。與DM組相比,白藜蘆醇治療組的腎小球硬化明顯改善。Masson染色結(jié)果表明糖尿病大鼠腎臟纖維化程度可通過白藜蘆醇治療顯著改善。1.2白藜蘆醇對糖尿病大鼠腎臟SIRT1表達(dá)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示DM組大鼠腎臟組織中SIRT1的表達(dá)較正常對照組明顯減少,白藜蘆醇治療后明顯增多。白藜蘆醇治療糖尿病大鼠后其腎組織中SOD活性較DM組明顯增多、MDA含量明顯減少。Western blot結(jié)果顯示白藜蘆醇治療組糖尿病大鼠腎臟組織中SIRT1、CAT蛋白表達(dá)較DM組明顯增加,但是FOXO3a的蛋白水平?jīng)]有變化。白藜蘆醇治療糖尿病大鼠后其腎組織SIRT1脫乙�；钚暂^DM組明顯增加。同時(shí)IP結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇治療組大鼠腎臟組織中乙酰化FOX03a的蛋白表達(dá)較DM組明顯下降。1.3白藜蘆醇緩解高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激損傷并增加SIRT1的脫乙酰化活性與高糖(HG)組相比,白藜蘆醇干預(yù)可以緩解高糖導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞中SOD的減少和MDA、ROS的增加。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)組HK-2細(xì)胞中SIRT1和CAT的蛋白表達(dá)較HG組明顯上升,但FOX03a的蛋白表達(dá)沒有變化。高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中SIRT1脫乙酰化活性明顯降低,但是白藜蘆醇干預(yù)可以緩解這一變化。同時(shí)IP結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中乙酰化FOX03a的蛋白水平比低糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中高,并且白藜蘆醇可以降低高糖導(dǎo)致的這一高水平乙�；疐OX03a表達(dá)。同時(shí)結(jié)果還顯示滲透壓并不影響上述氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá)。1.4 SIRT1對高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激的影響SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染后使HK-2細(xì)胞內(nèi)源性SIRT1的蛋白表達(dá)及基因水平均減少65%。CON siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后,白藜蘆醇干預(yù)可以顯著改善高糖引起的SOD減少,MDA、ROS和乙酰化FOX03a的增多。與CON siRNA轉(zhuǎn)染相比,SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞顯示出SOD明顯減少、MDA、ROS和乙酸化FOX03a明顯增多,但是SIRT1siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后,白藜蘆醇干預(yù)并不能改善高糖引起的以上氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化。2.白藜蘆醇通過調(diào)控SIRT1/P53緩解糖尿病大鼠腎臟的凋亡反應(yīng)2.1白藜蘆醇改善糖尿病大鼠代謝指標(biāo)及腎臟纖維化等病理異常與DM組相比,白藜蘆醇治療后空腹血糖、血肌酐、尿素氮無明顯改善,腎重/體重明顯下降。PAS染色顯示白藜蘆醇治療組大鼠腎臟糖原沉積較DM組明顯減少。與DM組相比,白藜蘆醇治療組的腎小球硬化明顯改善。Masson染色結(jié)果表明白藜蘆醇治療可顯著改善糖尿病大鼠腎臟纖維化程度。2.2白藜蘆醇對糖尿病大鼠腎臟SIRT1表達(dá)及凋亡指標(biāo)的影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果及western blot結(jié)果示DM組大鼠腎臟組織中SIRT1的表達(dá)較正常對照組明顯減少。與正常對照組相比,DM組大鼠腎臟組織中caspase-3及caspase-9活性均明顯增加。Western blot結(jié)果顯示與正常對照組比較,DM組cleaved caspase-3、cleaved PARP的蛋白顯著增多,白藜蘆醇治療后上述指標(biāo)均能明顯改善。2.3白藜蘆醇使糖尿病大鼠腎組織中SIRT1的脫乙�；钚栽黾硬⒛芙档鸵阴；疨53的蛋白表達(dá)白藜蘆醇治療糖尿病大鼠后其腎組織SIRT1脫乙�；钚暂^DM組明顯增加。同時(shí)western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇治療組大鼠腎臟組織中乙�；疨53的蛋白表達(dá)較DM組明顯下降。2.4高糖對腎小管上皮細(xì)胞凋亡反應(yīng)及SIRT1的脫乙�；钚缘挠绊懪c高糖刺激0 h(HGOh)相比,高糖刺激72h后HK-2細(xì)胞中MTT結(jié)果表現(xiàn)出細(xì)胞存活率顯著降低、JC-1染色結(jié)果顯示線粒體膜電位顯著降低、Hoechst33258染色結(jié)果顯示細(xì)胞核分裂顯著增加。高糖刺激48h、72h后,HK-2細(xì)胞的caspase-3活性明顯增加。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖刺激48 h、72 h后HK-2細(xì)胞中cleaved caspase-3、cleaved PARP的蛋白水平較HGOh組明顯上升,SIRT1的蛋白表達(dá)較HGOh組明顯減少。高糖刺激48h、72h后HK-2細(xì)胞的SIRT1脫乙�；钚悦黠@減少。Western blot結(jié)果顯示48 h、72 h后HK-2細(xì)胞的乙酰化P53的蛋白水平明顯增多,但P53的蛋白水平?jīng)]有變化。2.5白藜蘆醇對高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中凋亡指標(biāo)及SIRT1脫乙酰化活性的影響MTT結(jié)果顯示低糖狀態(tài)下白藜蘆醇(5 μM,10 μM,25 μM)干預(yù)對HK-2細(xì)胞的細(xì)胞存活率沒有影響,但是高糖狀態(tài)下25 μ白藜蘆醇治療可以顯著增加HK-2細(xì)胞的存活率。與HG組相比,白藜蘆醇干預(yù)組HK-2細(xì)胞中JC-1染色結(jié)果顯示線粒體膜電位顯著升高、Hoechst33258染色結(jié)果顯示細(xì)胞核分裂顯著減少、caspase-3活性顯著降低。Western blot結(jié)果示,白藜蘆醇干預(yù)顯著減少高糖誘導(dǎo)的cleaved caspase-3及cleaved PARP的蛋白水平。與HG組相比,白藜蘆醇干預(yù)使HK-2細(xì)胞的SIRT1蛋白表達(dá)及脫乙�；钚燥@著升高,并且減少乙酰化P53的蛋白含量,但是對P53的蛋白含量無明顯變化。結(jié)果還顯示在低糖和甘露醇組,以上指標(biāo)的改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.6 SIRT1對高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中凋亡的影響SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染后使HK-2細(xì)胞SIRT1的蛋白表達(dá)減少60%及基因水平減少65%。CON siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后,白藜蘆醇干預(yù)可以顯著改善高糖引起的細(xì)胞核分裂、caspase-3活性、cleaved caspase-3蛋白水平、cleaved PARP蛋白水平及乙�；疨53蛋白水平的增加,顯著改善高糖引起的線粒體膜電位和SIRT1脫乙酰化活性降低。與CONsiRNA轉(zhuǎn)染相比,SIRTIsiRNA轉(zhuǎn)染的腎小管上皮細(xì)胞顯示出細(xì)胞核分裂、caspase-3活性、cleaved caspase-3蛋白水平、cleaved PARP蛋白水平及乙�；疨53蛋白水平的增加,線粒體膜電位和SIRT1脫乙�；钚越档�。但是SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后,白藜蘆醇干預(yù)并不能改善高糖引起的以上凋亡指標(biāo)的變化。結(jié)論1.白藜蘆醇治療可以延緩DN的進(jìn)展,降低腎重/體重,改善腎功能。2.白藜蘆醇減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟纖維化。3.白藜蘆醇的作用機(jī)制與增加SIRT1的表達(dá)相關(guān)。白藜蘆醇通過增加SIRT1脫乙酰化活性,降低乙�；疐OXO3a的含量,減輕高糖引起的氧化應(yīng)激損傷。4.高糖狀態(tài)下,白藜蘆醇的保護(hù)機(jī)制與降低乙�；疨53水平相關(guān)。白藜蘆醇通過減少乙�；疨53的含量,緩解高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 Samy L Habib;;Diabetes and renal tubular cell apoptosis[J];World Journal of Diabetes;2013年02期

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本文編號：1691039