本文選題：IL-6　切入點(diǎn)：sIL-6R　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景和目的:牙周炎是口腔臨床中的常見病和多發(fā)病,是導(dǎo)致中老年人牙齒缺失的主要原因。菌斑生物膜是牙周炎發(fā)展的啟動(dòng)因素,牙周致病菌及其代謝產(chǎn)物在局部牙周組織積聚,.募集大量免疫細(xì)胞,引發(fā)炎癥和牙周支持組織(牙周韌帶、牙骨質(zhì)和牙槽骨)破壞,造成牙周袋形成和牙槽骨吸收,最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)和脫落。在牙周病的發(fā)展過程中,顯著而持續(xù)的炎癥微環(huán)境對牙槽骨的侵蝕破壞起著重要作用。由牙周致病菌刺激募集而來的單核-巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6、TNF-α IL-1等炎癥因子能夠直接或間接地招募破骨細(xì)胞前體細(xì)胞并促使其分化為成熟的破骨細(xì)胞,引起牙槽骨吸收破壞。IL-6是由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子,在體內(nèi)和體外都具有很強(qiáng)的促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的作用。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn),牙周炎患者局部牙周組織及齦溝液中IL-6水平明顯高于健康人群,經(jīng)過牙周基礎(chǔ)/序列治療后IL-6水平顯著降低,提示IL-6與牙周組織炎癥和牙槽骨吸收密切相關(guān)。以往研究認(rèn)為IL-6促進(jìn)骨吸收的作用是通過成骨細(xì)胞/間充質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的,即IL-6促使以上兩類細(xì)胞分泌破骨誘導(dǎo)因子RANKL,進(jìn)而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化成熟,而IL-6對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化本身無影響。然而近年來有研究表明IL-6也能夠通過破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的IL-6R直接調(diào)節(jié)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化,并且這個(gè)作用不是促進(jìn)而是抑制。對于以上研究的矛盾結(jié)果,目前學(xué)術(shù)界還沒有合理的解釋。sIL-6R是IL-6R的可溶性形式,與膜結(jié)合型IL-6R類似,也能夠與IL-6結(jié)合誘導(dǎo)gp-130的二聚化,從而激活I(lǐng)L-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),是經(jīng)典IL-6-IL-6R系統(tǒng)的有力補(bǔ)充。研究發(fā)現(xiàn)在很多情況下,只有在sIL-6R存在的情況下IL-6才能充分發(fā)揮其生理學(xué)作用。比如在沒有RANKL的情況下,IL-6與sIL-6R聯(lián)用能夠誘導(dǎo)少量純化破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的破骨向分化,而單獨(dú)使用IL-6則不能產(chǎn)生類似作用。因此,我們推測sIL-6R是IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必要補(bǔ)充,在研究IL-6與破骨細(xì)胞分化關(guān)系的時(shí)候有必要將sIL-6R的作用考慮其中。綜上,為了探究IL-6調(diào)節(jié)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的確切機(jī)制,我們分別建立了兩種破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(小鼠骨髓單核細(xì)胞BMMs和小鼠單核細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞)的體外誘導(dǎo)分化模型,以足量IL-6/sIL-6干預(yù)不同濃度RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化,觀察IL-6/sIL-6對體外破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。同時(shí)沿RANK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑,檢測RANK下游與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)通路的激活情況,初步探討IL-6/sIL-6對RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制,以期更深入地理解炎癥性骨吸收的病理發(fā)生以及炎癥因子對破骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié),為臨床研發(fā)新的更有效的牙周炎治療方法開辟一條新的思路。材料與方法:1.體外破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型的建立。分離培養(yǎng)小鼠骨髓單核細(xì)胞BMMs,購買小鼠單核細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞并傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長狀態(tài)良好后在培養(yǎng)基中加入30 ng/ml M-CSF和梯度濃度RANKL進(jìn)行破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)4天后行TRAP染色觀察多核破骨樣細(xì)胞的生成情況。為檢測破骨細(xì)胞骨吸收能力,將細(xì)胞接種于破骨細(xì)胞功能檢測板中,破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后觀察并統(tǒng)計(jì)破骨細(xì)胞吸收陷窩面積。2.IL-6/sIL-6R對不同濃度RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和活性影響的研究。在不加RANKL的情況下,以不同濃度IL-6、sIL-6R或IL-6+sIL-6R處理BMMs細(xì)胞,4天后TRAP染色觀察破骨樣細(xì)胞的生成情況。在加入梯度濃度RANKL的情況下,以不同濃度IL-6、sIL-6R或IL-6+sIL-6R處理BMMs細(xì)胞,4天后TRAP染色觀察破骨樣細(xì)胞的生成情況。破骨細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測破骨細(xì)胞的骨吸收能力;實(shí)時(shí)定量PCR檢測破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因TRAP、CK、CTR、MMP-9 mRNA的表達(dá);Western blot檢測破骨細(xì)胞生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NFATc1及c-fos的表達(dá)。3.IL-6/sIL-6R對不同濃度RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和活性的差異性調(diào)節(jié)的機(jī)制研究。以足量IL-6/sIL-6R分別干預(yù)10 ng/ml和50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)的BMMs破骨細(xì)胞分化體系,在0、2、4天收集細(xì)胞,Western blot檢測TRAF6蛋白的表達(dá);以 100 ng/ml IL-6/sIL-6R 預(yù)處理 BMMs 細(xì)胞,然后分別以 10 ng/ml 和 50 ng/ml RANKL進(jìn)行誘導(dǎo),在0、5、15、30分鐘時(shí)收集細(xì)胞,用免疫共沉淀法檢測RANK與TRAF6蛋白的結(jié)合情況;以100 ng/ml IL-6/sIL-6R預(yù)處理BMMs細(xì)胞,然后分別以10 ng/ml和50 ng/ml RANKL進(jìn)行誘導(dǎo),在0、15、30、60分鐘時(shí)收集細(xì)胞,Western blot 檢測 p-p-38、p38;p-ERK、ERK;p-JNK、JNK;p-Akt、Akt;p-NF-κB、NF-κB的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.體外破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型的建立。BMMs和RAW264.7細(xì)胞都能在RANKL的誘導(dǎo)下分化為TRAP染色陽性的多核巨細(xì)胞且具有在破骨細(xì)胞功能檢測板上形成吸收陷窩的能力。BMMs和RAW264.7細(xì)胞分化形成的破骨細(xì)胞在形態(tài)、大小和骨吸收能力方面有差別。由以上兩種細(xì)胞誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量、大小和骨吸收能力與所使用RANKL的濃度呈劑量相關(guān)性,50 ng/ml為RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的飽和濃度。2.IL-6/sIL-6R對不同濃度RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和活性影響的研究。單獨(dú)應(yīng)用IL-6或sIL-6R都不能誘導(dǎo)TRAP染色陽性的破骨樣細(xì)胞生成,IL-6與sIL-6R聯(lián)用能夠誘導(dǎo)少量的、體積較小的破骨樣細(xì)胞生成。sIL-6R對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成無影響;IL-6抑制高濃度RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成;IL-6/sIL-6R能夠促進(jìn)低濃度(10ng/ml)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成而抑制高濃度(50ng/ml)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明IL-6/sIL-6R對不同濃度的RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的差異性調(diào)節(jié)還體現(xiàn)在骨吸收活性、破骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因(CTR、CK、MMP-9和TRAP)和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(NFATcl和c-fos)表達(dá)上,與TRAP染色結(jié)果一致。3.IL-6/sIL-6R對不同濃度RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和活性的差異性調(diào)節(jié)的機(jī)制研究。Western blot結(jié)果顯示IL-6/sIL-6R不改變RANKL刺激下破骨細(xì)胞前體細(xì)胞TRAF6蛋白的表達(dá);免疫共沉淀結(jié)果顯示高/低濃度RANKL誘導(dǎo)的RANK-TRAF6結(jié)合也不受IL-6/sIL-6R預(yù)處理的影響。信號(hào)通路研究表明IL-6/sIL-6R分別促進(jìn)/抑制了低/高濃度RANKL誘導(dǎo)的NF-κB、ERK和JNK信號(hào)通路的激活,但是對p-38、Akt信號(hào)通路無明顯影響。結(jié)論:1.分離培養(yǎng)小鼠骨髓單核細(xì)胞BMMs和小鼠單核細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系,用M-CSF和不同濃度RANKL進(jìn)行破骨分化誘導(dǎo),并進(jìn)行了初步的破骨細(xì)胞形態(tài)及功能鑒定,成功建立了體外破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型。2.IL-6/sIL-6R促進(jìn)了低濃度(10 ng/ml)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化,而對高濃度(50 ng/ml)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化表現(xiàn)為抑制作用。3.IL-6/sIL-6R對不同濃度RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的差異性調(diào)節(jié)發(fā)生在TRAF6的下游,可能是通過IL-6-IL-6R-gp130信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)RANKL介導(dǎo)的NF-κB、ERK和JNK信號(hào)通路的激活實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：1659410