本文選題：酒精性脂肪肝　切入點(diǎn)：肝纖維化　出處：《延邊大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:肝纖維化是一種發(fā)生在肝臟、循序而漸進(jìn)的病理損傷,隨著肝纖維化研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)肝纖維化過程中炎癥反應(yīng)始終貫穿始終。P2x7受體(purinergic receptor,P2x7R)屬于嘌呤受體家族,是P2x家族的7個(gè)不同亞型(P2x1-7)中的一種。它在人體中分布廣泛,特別是與炎癥反應(yīng)過程直接相關(guān)。因而是否可以通過影響P2x7R來實(shí)現(xiàn)對(duì)酒精性脂肪肝的調(diào)控,摸索其中的潛在聯(lián)系與機(jī)制,是我們要探究的問題。方法:(1)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)預(yù)處理巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基間接刺激人系肝星狀細(xì)胞株LX2細(xì)胞與直接LPS刺激LX2細(xì)胞的組別相比較,ELISA與 Western Blot 檢測細(xì)胞因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),白介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)表達(dá)情況。Western Blot與RT-PCR檢測蛋白與mRNA的表達(dá)水平;LX2細(xì)胞給予LPS刺激4h,加入三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)時(shí)間為30min,加入 ATP 前 1Omin 給予 P2x7R 拮抗劑 A438079。Western Blot 與 RT-PCR 驗(yàn)證LX2細(xì)胞激活過程中炎癥因子P2x7R、NOD樣受體家族成員(NLRs)NLRP3和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 1(cysteinyl aspartate specificproteinas,caspase-1)表達(dá)。同時(shí)檢測肝纖維化標(biāo)志蛋白Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen,collagen I)和平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白mRNA表達(dá)情況;沉默P2x7R后檢測相關(guān)炎癥小體與肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。(2)建立硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)肝纖維化模型,采用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組:正常組(n=5),模型TAA組(n=14)與模型TAA給藥A438079組(n=5)。除正常組,第一周腹腔注射給予TAA(100 mg/kg)給藥,從第二周到第六周內(nèi)TAA(200 mg/kg),從第5周起給藥組每周給予A438079(30mg/kg)3次,持續(xù)兩周。第6周給藥結(jié)束后處死,收取血清,肝臟等樣本。蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)、免疫組化法(Immunohistochemistry,IHC)、麻松三色染色(Masson's Trichrome Staining)、免疫熒光染色(Immunofluorescence Staining,IF)檢測炎癥相關(guān)因子 NLRP3、核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor kB,NF-kB)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和F4/80的表達(dá)情況。結(jié)合Western Blot與RT-PCR檢測肝纖維化相關(guān)標(biāo)志collagenI、α-SMA的表達(dá)。(3)對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞(AML12)給予酒精(50mM)、二甲雙胍與AMP依賴的蛋白激酶(AMP dependent kinase,AMPK)通路抑制劑 Compound C 刺激 24h,利用 Wertern Blot檢測炎癥因子與脂肪代謝相關(guān)沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirtuin1,SIRT1)、過氧化物增殖劑激活受體(PeroxisomeproliferatoractivatedReceptor-alpha,PPARα)蛋白表達(dá)結(jié)果,凋亡相關(guān)因子半胱天冬酶3,即caspase-3表達(dá)情況。(4)慢性酒精加急性酒精灌胃模型,采用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照飼料組,慢性酒精加酒精急性灌胃組,酒精給藥組以及單獨(dú)給藥組。給藥組每天皮下注射給藥A438079(30mg/kg)。實(shí)驗(yàn)階段,分別給予對(duì)照飼料與酒精飼料10天喂養(yǎng)。第11天單次酒精灌胃的計(jì)量為5g/kg,9小時(shí)后處死并收集樣本。利用Western Blot與RT-PCR檢測炎癥因子與肝纖維化標(biāo)志因子的蛋白與mRNA表達(dá)情況,對(duì)肝臟病理切片進(jìn)行染色分析肝纖維化與炎癥因子浸潤情況。結(jié)果:(1)LX2細(xì)胞經(jīng)過LPS刺激后分泌IL-1β和IL-1α。LX2細(xì)胞經(jīng)過LPS與ATP聯(lián)合作用,肝纖維化相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)collagen I、α-SMA以及P2x7R和caspase-1、NLRP3炎癥小體的mRNA與蛋白表達(dá)升高;預(yù)處理P2x7R拮抗劑A438079可以有效降低上述因子的表達(dá)。(2)TAA所致的肝纖維化模型中,A438079可以在體內(nèi)降低TAA引起的caspase-1、NLRP3炎癥小體與纖維化指標(biāo)標(biāo)collagen I、α-SMA和TIMP 1的蛋白與mRNA表達(dá),在病理學(xué)上改善模型組的病變情況。(3)在AML12細(xì)胞中,A438079可以有效降低酒精誘發(fā)的PPARα、caspase-3、P-AMPK、SIRT 1的蛋白表達(dá)。(4)慢性加急性酒精灌胃模型中,P2x7R拮抗劑A438079可以降低酒精誘發(fā)的ALT/AST指標(biāo)升高,在病理學(xué)上改善模型組的病變情況以及collagen I、α-SMA、P-AMPK、SIRT1、LIPIN 1的蛋白表達(dá)。結(jié)論:P2x7R介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活可以促使IL-1β分泌,間接促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,在肝臟中調(diào)節(jié)酒精性脂肪肝進(jìn)程。說明P2x7R在肝纖維化和酒精性脂肪肝治療過程中會(huì)是一個(gè)有效的研究靶點(diǎn)。
[Abstract]:Objective: hepatic fibrosis is a pathological injury occurring in the liver, gradual and progressive, with the study of hepatic fibrosis further revealed inflammatory reaction in the process of liver fibrosis always runs through the.P2x7 receptor (purinergic receptor P2x7R) belongs to the purine receptor family, is one of 7 different subtypes of the P2x family (P2x1-7) in a. It is widely distributed in the human body, especially directly associated with the inflammatory process. Therefore, whether the influence of P2x7R to realize the regulation of alcoholic fatty liver, and explore the potential link mechanism, we want to explore issues. Methods: (1) lipopolysaccharide (lipopolysaccharide, LPS) medium pretreatment macrophage indirect stimulation system of hepatic stellate cell line LX2 and LPS directly stimulate LX2 cells compared with Western group, ELISA Blot detection of interleukin -1 beta (Interleukin-1 beta, beta IL-1), interleukin -1 alpha (Interleukin-1 alpha, IL-1 alpha and tumor necrosis factor (tumor) necrosis factor alpha, TNF- alpha) expression of.Western Blot and RT-PCR protein and mRNA; LX2 cells stimulated with LPS 4h, adenosine triphosphate (adenosine-triphosphate, ATP) with time 30min, before joining ATP 1Omin P2x7R antagonist A438079.Western Blot and RT-PCR to verify the LX2 cell activation of inflammatory cytokines in P2x7R process, members of the family of NOD like receptors (NLRs) aspartic acid proteases NLRP3 and cysteine (1 cysteinyl aspartate specificproteinas, caspase-1). The expression of simultaneous detection of liver fibrosis marker protein collagen type I (type I collagen, collagen I) and smooth muscle actin (alpha-smooth muscle actin alpha, -SMA) protein mRNA expression; the expression of inflammatory corpuscle with hepatic fibrosis gene silence detection after P2x7R (2). The establishment of thioacetamide (Thioacetamide, TAA) model of liver fibrosis, C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups: normal group (n=5), TAA model group (n=14) and model TAA administration A438079 group (n=5). In addition to the normal group, the first week of intraperitoneal injection of TAA (100 mg/kg) administration, from second sixth weeks in TAA (200 mg/kg), the drug group received A438079 from the fifth week (30mg/kg) 3 times, for two weeks. Sixth weeks after the administration were collected serum, liver samples. Hematoxylin eosin staining (hematoxylin-eosin staining HE), immunohistochemistry (Immunohistochemistry IHC, MA), pine (Masson's Trichrome Staining) staining, immunofluorescence staining (Immunofluorescence, Staining, IF) detection of inflammatory cytokines NLRP3, nuclear transcription factor (NF-kB Nuclear factor kB), myeloperoxidase (myeloperoxidase, MPO) and the expression of F4/80 and RT-PC combined with Western Blot. Mark R detection of liver fibrosis in collagenI, the expression of alpha -SMA. (3) on mouse liver cells (AML12) with alcohol (50mM), metformin and AMP dependent protein kinase (AMP dependent kinase AMPK Compound C 24h) pathway inhibitor stimulation, measured inflammatory cytokines and lipid metabolism by Wertern Blot silent information regulator check (Sirtuin1, SIRT1), peroxisome proliferator activated receptors (PeroxisomeproliferatoractivatedReceptor-alpha, PPAR alpha) protein expression, apoptosis related factors of caspase 3, namely, the expression of Caspase-3. (4) chronic alcohol and acute alcohol gavage model, C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups: control group, chronic alcohol and feed. Acute alcohol gavage group, alcohol administration group and single drug group. The drug group daily subcutaneous injection of A438079 (30mg/kg). The experimental stage, were given control diet and alcohol feed 10 Day eleventh days feeding. Measurement of single alcohol gavage for 5g/kg, were sacrificed after 9 hours and collect samples. By using Western Blot and RT-PCR detection of inflammatory cytokines and hepatic fibrosis markers expression factor protein and mRNA staining analysis of liver fibrosis and inflammation by infiltration of liver biopsy. Results: (1) LX2 cells after LPS stimulated secretion of IL-1 beta and IL-1 alpha.LX2 cells after the combined effect of LPS and ATP, the indexes of hepatic fibrosis and P2x7R collagen I, alpha -SMA and caspase-1, increased mRNA and protein expression of NLRP3 inflammasome; pretreatment with the P2x7R antagonist A438079 can effectively reduce the expression of the above factors. (2) liver fibrosis model induced by TAA, A438079 can be reduced in vivo by TAA caspase-1, NLRP3 inflammasome and fibrosis indexes collagen, I, -SMA and TIMP 1 alpha and mRNA protein in pathological improvement mode The lesion type group. (3) in AML12 cells, A438079 can effectively reduce the alcohol induced PPAR alpha, Caspase-3, P-AMPK, the expression of SIRT 1 protein. (4) chronic acute alcohol administration model, the P2x7R antagonist A438079 can decrease the ALT/AST index of alcohol induced pathological changes in the. The lesion of the model group, collagen I, P-AMPK, SIRT1, alpha -SMA, the expression of LIPIN 1 protein. Conclusion: NLRP3 inflammasome mediated P2x7R activation can induce IL-1 beta secretion, indirectly promote the occurrence and development of liver fibrosis, regulation of alcoholic fatty liver in the liver. P2x7R process will be an effective the research target in liver fibrosis and alcoholic fatty liver in the treatment process.

【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：1614803