本文選題：黃芪多糖　切入點：細(xì)胞遷移　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景胃腸黏膜損傷是胃腸道疾病的發(fā)病基礎(chǔ)之一。多種胃腸疾病存在胃腸黏膜損傷的病理改變。以益氣健脾法治療慢性胃炎、消化性潰瘍、炎癥性腸病等疾病證屬脾虛者有確切療效,益氣健脾方藥對胃腸道相關(guān)病癥的治療作用可能與其保護(hù)胃腸黏膜完整及促進(jìn)黏膜損傷后修復(fù)的作用有密切關(guān)系。胃腸黏膜是人體更新最快的組織,具有很強(qiáng)的自我修復(fù)能力。胃腸黏膜損傷后修復(fù)包括快速整復(fù)階段和后續(xù)的修復(fù)階段。快速整復(fù)階段主要在損傷后數(shù)分鐘至數(shù)小時發(fā)生,由損傷附近的剩余的有活性的細(xì)胞向損傷部位遷移并重新覆蓋損傷部位,此過程不依賴細(xì)胞增殖。在小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)的研究表明,多胺對細(xì)胞遷移是必需的。多胺可通過增加細(xì)胞電壓門控鉀通道蛋白Kv1.1表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞膜電位超極化而調(diào)控Ca~(2+)內(nèi)流驅(qū)動力;儲存操縱性鈣通道(SOC)是細(xì)胞Ca~(2+)內(nèi)流主要通道之一,TRPC1作為SOC通道蛋白,對調(diào)控Ca~(2+)內(nèi)流驅(qū)動力和[Ca~(2+)]cyt起重要作用。STIM1作為胞內(nèi)鈣庫Ca~(2+)感應(yīng)器是激活SOC的關(guān)鍵指標(biāo);胞內(nèi)鈣庫Ca~(2+)耗竭時STIM1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位到漿膜與TRPC1形成STIM1/TRPC1復(fù)合體,進(jìn)而增強(qiáng)TRPC1介導(dǎo)的Ca~(2+)內(nèi)流而促進(jìn)細(xì)胞遷移。STIM2是SOC的負(fù)調(diào)控蛋白,多胺通過改變ST1M1和ST1M2的比率而調(diào)控TRPC1介導(dǎo)的Ca~(2+)信號;[Ca~(2+)yt增加則激活下游的Rho-GTPases,MLC磷酸化增加,刺激應(yīng)力纖維形成和細(xì)胞骨架重排而促進(jìn)細(xì)胞遷移。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益氣健脾方藥如白術(shù)、黨參、黃芪、甘草提取物(多糖、黃酮提取物等)及四君子湯糖等可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移,作用機(jī)制與其影響多胺信號通路有關(guān),其中Ca~(2+)調(diào)控是關(guān)鍵指標(biāo)。研究目的篩選藥效活性較高的黃芪多糖組分為受試藥,觀察其對小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)遷移過程多胺信號通路(尤其是Ca~(2+)調(diào)控指標(biāo))的影響,探討益氣健脾中藥黃芪促進(jìn)胃腸黏膜損傷修復(fù)的作用機(jī)制及藥效物質(zhì),為其臨床治療胃腸黏膜損傷的療效機(jī)制提供參考。研究方法1.黃芪多糖提取、分離和純化:黃芪藥材經(jīng)水提醇沉法、Sevag去蛋白、DEAE-52纖維素柱層析、Sephadex葡聚糖柱層析,分別得到黃芪多糖1、2、3、4樣品;苯酚-硫酸法測定黃芪多糖各樣品的多糖含量;高效液相色譜法進(jìn)行黃芪多糖3、4樣品純度分析。2.在細(xì)胞遷移模型篩選受試藥:劃痕法IEC-6細(xì)胞遷移模型觀察黃芪多糖4種樣品對細(xì)胞遷移的影響,篩選出促進(jìn)細(xì)胞藥理活性最佳的多糖樣品為后續(xù)研究受試藥。3.作用機(jī)制指標(biāo)檢測:①RT-qPCR測定TRPC1、STIM1、STIM2mRNA表達(dá)。② Western Blot 檢測 Kv1.1、TRPC1、STIM1、STIM2、RhoA、Rac1、Cdc42 蛋白表達(dá)。③流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞膜電位(Em)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子水平([Ca~(2+)]cyt)。④免疫熒光法檢測STIM1蛋白表達(dá)及分布。⑤免疫沉淀法檢測STIM1/TRPC1、STIM1/STIM2復(fù)合體蛋白表達(dá)。研究結(jié)果1.黃芪多糖提取、分離和純化:①黃芪多糖1、2、3、4的得率分別為:5.64%、3.34%、1.50%、6.5‰。②黃芪多糖 1、2、3、4 的多糖含量分別為 31.0%、50.9%、66.3%、45%。以"黃芪多糖3"多糖含量最高。2.黃芪多糖各樣品對細(xì)胞遷移的影響:黃芪多糖4種樣品均能促進(jìn)細(xì)胞遷移,以"黃芪多糖3"促進(jìn)細(xì)胞遷移藥效最佳,故確定為后續(xù)實驗受試藥。實驗劑量設(shè)為:20mg/L～160mg/L。3."黃芪多糖3"(以下簡稱"黃芪多糖")對細(xì)胞遷移的影響:黃芪多糖能促進(jìn)細(xì)胞遷移,逆轉(zhuǎn)DFMO(多胺合成抑制劑)對細(xì)胞遷移的抑制,提示黃芪多糖促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用與其提高細(xì)胞內(nèi)多胺含量有關(guān)。4.黃芪多糖對細(xì)胞遷移多胺信號通路Ca~(2+)調(diào)控的影響(1)對Ca~(2+)調(diào)控上游指標(biāo)的影響:①提高鉀通道蛋白Kv1.1表達(dá);逆轉(zhuǎn)DFMO對Kv1.1表達(dá)的抑制;②提高細(xì)胞膜電位超極化水平,逆轉(zhuǎn)DFMO所致的膜電位去極化。提示黃芪多糖可通過激活鉀通道和提高細(xì)胞膜電位而增加Ca~(2+)內(nèi)流驅(qū)動力。(2)對Ca~(2+)調(diào)控指標(biāo)的影響:①促進(jìn)胞內(nèi)Ca~(2+)感應(yīng)器STIM1蛋白移位至細(xì)胞漿膜,改善DFMO對STIM1移位的抑制,提高STIM1在細(xì)胞膜的表達(dá);②提高STIM1 mRNA和蛋白表達(dá),逆轉(zhuǎn)DFMO對STIM1 mRNA和蛋白表達(dá)的抑制;減少Ca~(2+)負(fù)調(diào)控因子STIM2 mRNA和蛋白表達(dá);抑制DFMO所致的STIM2 mRNA和蛋白表達(dá)的升高。③增加TRPC1/STIM1復(fù)合體蛋白表達(dá),減少STIM1/STIM2復(fù)合體蛋白表達(dá);增加DFMO負(fù)荷時TRPC1/STIM1復(fù)合體中TRPC1、STIM1蛋白表達(dá);減少DFMO負(fù)荷下STIM1/STIM2復(fù)合體中STIM2蛋白表達(dá)。提示黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣庫Ca~(2+)感應(yīng)指標(biāo)進(jìn)而影響TRPC1介導(dǎo)的Ca~(2+)信號。(3)對鈣通道蛋白和[Ca~(2+)]cyt的影響:①提高鈣通道蛋白TRPC1mRNA和蛋白表達(dá),減少DFMO所致的TRPC1 mRNA和蛋白表達(dá)抑制;②提高[Ca~(2+)]cyt,逆轉(zhuǎn)DFMO所致的[Ca~(2+)]cyt降低;若去除細(xì)胞外Ca~(2+)內(nèi)流途徑(使用無鈣培養(yǎng)液),則不但無鈣對照組細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少,且黃芪多糖促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用也明顯減弱。提示黃芪多糖可通過增強(qiáng)TRPC1介導(dǎo)的Ca~(2+)內(nèi)流、提高[Ca~(2+)]cyt而促進(jìn)細(xì)胞遷移。(4)對Ca~(2+)調(diào)控下游指標(biāo)的影響:提高Rho-GTPase(RhoA、Rac1、Cdc42)蛋白表達(dá);逆轉(zhuǎn)DFMO對RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表達(dá)的抑制。提示黃芪多糖可通過提高Ca~(2+)調(diào)控下游指標(biāo)Rho-GTPase而促進(jìn)細(xì)胞遷移。研究結(jié)論黃芪多糖是黃芪促進(jìn)細(xì)胞遷移的有效組分之一,作用機(jī)制與其影響細(xì)胞遷移多胺信號通路有關(guān),尤其Ca~(2+)是關(guān)鍵調(diào)控指標(biāo)之一,可通過調(diào)節(jié)[Ca~(2+)]cyt上下游相關(guān)指標(biāo)促進(jìn)細(xì)胞遷移。研究結(jié)果為探討益氣健脾中藥黃芪胃腸黏膜損傷修復(fù)機(jī)制提供了參考。
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【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1615620