本文選題：腦缺血再灌注損傷　切入點(diǎn)：炎癥　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：缺血性腦卒中發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高,是危害我國(guó)人民健康的主要疾病之一。雖然現(xiàn)在已明確了超早期溶栓的有效性,但由于其嚴(yán)格的治療時(shí)間窗,其臨床應(yīng)用受到一定的限制。因此,腦缺血后如何減輕繼發(fā)性腦損傷是目前臨床面臨的重要課題。研究表明腦缺血后發(fā)生在缺血半暗帶的過(guò)度的炎癥反應(yīng)是造成繼發(fā)性腦損傷的主要原因:阻斷抗炎信號(hào)通路加重繼發(fā)性腦損傷,而抑制炎癥介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)則減輕腦缺血后繼發(fā)性腦損傷。因此,尋找炎癥反應(yīng)的有效靶點(diǎn)進(jìn)行靶向干預(yù),是減輕缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。鞘磷脂由鞘氨醇、脂酸和磷酸膽堿構(gòu)成,是人體內(nèi)含量最多的鞘磷脂,也是構(gòu)成生物膜的重要組分,與卵磷脂并存于細(xì)胞膜外側(cè),廣泛存在于生物組織內(nèi),在腦組織中含量尤為豐富。鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthase,SMS)是鞘磷脂合成途徑中的最后一個(gè)酶,SMS有兩種同工酶:SMS1和SMS2。SMS1主要存在于高爾基體,而SMS2主要存在于質(zhì)膜上,在腦組織中廣泛表達(dá)。其中SMS2是炎癥反應(yīng)中重要的調(diào)控因子。SMS2缺乏可抑制由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TLR4/NF-κB通路的活化,提示SMS2參與了對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控。但目前關(guān)于SMS2對(duì)腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制尚不清楚,仍有待于進(jìn)一步研究。近期研究發(fā)現(xiàn),腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的半乳糖凝集素-3(galectin-3),galectin-3是TLR4的內(nèi)源性配體,其通過(guò)誘導(dǎo)TLR4募集到脂筏區(qū)域并與之結(jié)合激活TLR4通路,加重炎癥反應(yīng)。脂筏是細(xì)胞膜上由神經(jīng)鞘磷脂、膽固醇和鞘糖脂相互作用形成的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)微結(jié)構(gòu)域,與膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選密切相關(guān)。第一部分鞘磷脂合成酶2缺乏減輕了小鼠腦缺血再灌注損傷目的:通過(guò)對(duì)野生型(WT)小鼠和SMS2敲除(SMS2-/-)小鼠在腦缺血再灌注損傷后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積測(cè)定,觀察SMS2缺乏對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的作用。方法:實(shí)驗(yàn)選用8-12周齡的健康雄性C56BL/6小鼠及以C57BL/6為背景的SMS2敲除小鼠為研究對(duì)象。采用線栓法建立的小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。實(shí)驗(yàn)分為WT小鼠和SMS2-/-小鼠兩組,分別在手術(shù)造模后24小時(shí)和72小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色測(cè)定腦梗死體積。結(jié)果:1在腦缺血再灌注后72小時(shí),與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠的神經(jīng)缺損評(píng)分明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而在腦缺血再灌注后24小時(shí),SMS2-/-小鼠的神經(jīng)缺損評(píng)分與WT小鼠相比無(wú)明顯改變,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2非缺血側(cè)的小鼠腦片經(jīng)TTC染色后呈現(xiàn)均勻一致的紅色,而缺血側(cè)的小鼠腦片經(jīng)TTC染色后在皮質(zhì)及基底節(jié)區(qū)的梗死區(qū)域呈現(xiàn)大范圍的白色。在腦缺血再灌注后24小時(shí)和72小時(shí),與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠的梗死體積明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);第二部分鞘磷脂合成酶2缺乏減輕了小鼠腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)目的:通過(guò)測(cè)定小鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶炎癥因子的表達(dá)、小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤(rùn)情況及TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)水平觀察鞘磷脂合成酶2缺乏對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的影響。方法:實(shí)驗(yàn)選用8-12周齡的健康雄性C56BL/6(WT)小鼠及以C57BL/6為背景的SMS2敲除小鼠(SMS2-/-)為研究對(duì)象。采用線栓法建立的小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將WT小鼠和SMS2-/-小鼠隨機(jī)分為2組:假手術(shù)組(Sham)和大腦中動(dòng)脈閉塞組(t MCAO)。各組小鼠分別在手術(shù)造模后24小時(shí)和72小時(shí),應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)炎癥因子的表達(dá),應(yīng)用免疫熒光染色的方法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤(rùn),應(yīng)用Western-blot檢測(cè)NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR4及TLR4/MD2復(fù)合體的表達(dá)情況。結(jié)果:1 RT-PCR的結(jié)果顯示:在腦缺血再灌注損傷后24小時(shí)和72小時(shí),與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠腦組織缺血半暗帶炎癥因子(IL-1β,galectin-3)m RNA水平的表達(dá)明顯降低,抑炎因子Arg-1的m RNA水平表達(dá)明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2 Western blot的結(jié)果顯示:與正常組相比,galectin-3蛋白水平的表達(dá),在腦缺血再灌注后48小時(shí)和72小時(shí)明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);在腦缺血后72小時(shí),與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠的galectin-3蛋白水平的表達(dá)明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3免疫熒光的結(jié)果顯示:與非缺血側(cè)相比,缺血側(cè)Iba-1+的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);在腦缺血再灌注后72小時(shí),與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠缺血側(cè)galectin-3+Iba-1+的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);而Iba-1+的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與WT小鼠相比無(wú)明顯改變,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4 Western blot的結(jié)果顯示:在腦缺血再灌注損傷后24小時(shí)和72小時(shí),與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠腦組織缺血半暗帶NF-κB的核轉(zhuǎn)位明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示:在腦缺血再灌注后72小時(shí),與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR4/MD2復(fù)合體的表達(dá)減少;而TLR4的表達(dá)較WT小鼠無(wú)明顯改變。第三部分鞘磷脂合成酶2缺乏通過(guò)抑制TLR4向脂筏區(qū)域的募集發(fā)揮抗炎作用目的:通過(guò)測(cè)定小鼠腦缺血再灌注損傷后TLR4在脂筏組分和非脂筏組成的表達(dá)情況,以及鞘磷脂合成酶2缺乏后對(duì)脂筏成分及功能的影響,探討其在腦缺血再灌注損傷后發(fā)揮抗炎作用的可能作用機(jī)制。方法:采用8-12周齡的健康雄性C57BL/6小鼠(WT)及以C57BL/6小鼠為背景的SMS2敲除小鼠(SMS2-/-)作為研究對(duì)象,通過(guò)線栓法建立小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將WT和SMS2-/-小鼠隨機(jī)分為2組:假手術(shù)組(Sham)和大腦中動(dòng)脈閉塞組(t MCAO)。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)和72小時(shí),應(yīng)用蔗糖梯度離心的方法檢測(cè)脂筏區(qū)域及非脂筏區(qū)域TLR4的表達(dá)情況,應(yīng)用液相串聯(lián)質(zhì)譜的發(fā)放(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)測(cè)定各組分鞘磷脂(sphingomyelin,SM)的含量。結(jié)果:1蔗糖密度梯度離心結(jié)果顯示:與正常組相比,在腦缺血再灌注后24小時(shí)和72小時(shí),TLR4在脂筏區(qū)域大量表達(dá);與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠TLR4在脂筏區(qū)域的表達(dá)明顯減少。2 LC-MS/MS測(cè)定SM含量的結(jié)果顯示:與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠C14-SM,C16-SM,C18:1-SM,C18-SM,C20:1-SM和C24:1-SM在脂筏區(qū)域的含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用線栓法成功建立了小鼠短暫性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型,發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注后72小時(shí),與WT小鼠相比,SMS2-/-小鼠的神經(jīng)功能明顯得到改善,腦梗死體積顯著減少。2 SMS2缺乏在腦缺血再灌注損傷后發(fā)揮的腦保護(hù)作用,有可能與其減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、減少NF-κB的核轉(zhuǎn)位、減少促炎因子的表達(dá)有關(guān)。3 SMS2缺乏通過(guò)減少脂筏組分SM的含量影響脂筏的功能,從而抑制TLR4受體由非脂筏區(qū)域向脂筏區(qū)域的募集,減少TLR4/MD2復(fù)合體的形成,進(jìn)而抑制下游TLR4/NF-κB炎癥通路的激活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.3

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本文編號(hào)：1614428