本文選題：多發(fā)性骨髓瘤　切入點(diǎn)：PDK1　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分PDK1抑制劑GSK2334470單藥及聯(lián)合mTOR抑制劑PP242的抗骨髓瘤作用研究目的:研究PDK1抑制劑GSK-470的抗骨髓瘤作用及其分子機(jī)制;通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),探討GSK2334470協(xié)同mTOR抑制劑PP242抑制骨髓瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制。方法:采用MTT法檢測GSK2334470和/或PP242對(duì)多發(fā)性骨髓瘤(multiply myeloma,MM)細(xì)胞株和患者原代細(xì)胞的生長抑制作用;流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡;Western blot 檢測 Caspase-3/8/9、PARP、PI3K/PDK1/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。構(gòu)建RPMI8226細(xì)胞荷瘤小鼠模型,檢測GSK2334470和/或PP242對(duì)小鼠瘤體生長的影響。結(jié)果:1.GSK2334470可以抑制骨髓瘤細(xì)胞株及原代MM患者細(xì)胞生長,呈濃度依賴性;對(duì)正常細(xì)胞株無明顯毒性作用。2.外源性IL-6和IGF-1不能逆轉(zhuǎn)GSK2334470對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株的殺傷作用。3.GSK2334470可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞株和原代細(xì)胞發(fā)生凋亡,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 和 PARP 被激活。4.GSK2334470通過抑制PDK1的磷酸化來調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路及其下游蛋白。5.GSK2334470可以協(xié)同PP242殺傷骨髓瘤細(xì)胞株和原代細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。6.PP242通過抑制mTORC2、下調(diào)Akt第473位點(diǎn)上絲氨酸的磷酸化來增強(qiáng)GSK2334470的抗骨髓瘤作用,兩者聯(lián)用完全抑制了 Akt和mTORC1/C2的活性。7.GSK2334470、PP242均可抑制MM荷瘤小鼠瘤體的生長,但聯(lián)合組的抑制作用更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;聯(lián)合組瘤體的mTORC1和mTORC2的活性都有明顯下降。第二部分PTEN在PDK1抑制劑GSK2334470抗骨髓瘤作用中的重要性研究目的:研究和比較GSK2334470對(duì)四種MM細(xì)胞株殺傷作用的差異及其與PTEN基因的關(guān)系;通過腺病毒或藥物改變骨髓瘤細(xì)胞中PTEN蛋白的水平來進(jìn)一步證實(shí)PTEN在GSK2334470抗骨髓瘤作用中重要性;研究GSK2334470與蛋白酶體抑制劑MG132的協(xié)同抗骨髓瘤作用及其機(jī)制。方法:采用MTT法檢測生長抑制作用;流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡;PCR和Western blot檢測MM細(xì)胞株P(guān)TEN的本底表達(dá);腺病毒轉(zhuǎn)染使MM細(xì)胞株過表達(dá)或低表達(dá)PTEN;Western blot檢測胞漿PTEN、胞核PTEN及PI3K/PDK1/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。激光共聚焦檢測PTEN蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布。結(jié)果:1.GSK2334470對(duì)四種骨髓瘤細(xì)胞殺傷作用有明顯的差異,對(duì)ARP-1和MM.1R較敏感;ARP-1、MM.1R凋亡細(xì)胞比例也明顯高于RPMI8226和OPM-2;與細(xì)胞株的PTEN表達(dá)呈正相關(guān)。2.通過腺病毒轉(zhuǎn)染改變MM細(xì)胞株P(guān)TEN的表達(dá),可改變GSK2334470的敏感性。3.MG132通過增加細(xì)胞中PTEN的表達(dá),調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路及其下游蛋白,協(xié)同GSK2334470殺傷骨髓瘤細(xì)胞,誘導(dǎo)凋亡。4.GSK2334470可以使MM細(xì)胞株胞漿中高表達(dá)的PTEN向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,明確了 GSK2334470抗骨髓瘤作用的其他機(jī)制,與MG132協(xié)同抗骨髓瘤的分子機(jī)制。結(jié)論:GSK2334470通過抑制PDK1的磷酸化來調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路,誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡;mTOR抑制劑PP242通過抑制mTORC2和p-Akt S473的磷酸化協(xié)同GSK2334470發(fā)揮抗骨髓瘤作用。GSK2334470的敏感性與MM細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)水平有關(guān);可通過蛋白酶體抑制劑MG132或腺病毒轉(zhuǎn)染增加細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)提高GSK2334470的殺傷作用;同時(shí)GSK2334470還可以使高表達(dá)的PTEN發(fā)生核轉(zhuǎn)移,與MG132發(fā)揮協(xié)同抗MM作用。提示靶向抑制PDK1及聯(lián)合mTOR抑制劑或蛋白酶體抑制劑可能是多發(fā)性骨髓瘤治療的新的措施。
[Abstract]:Objective to study the antitumor action of bone marrow Part 1 PDK1 inhibitor GSK2334470 monotherapy and in combination with the mTOR inhibitor PP242: anti myeloma effect of PDK1 inhibitor GSK-470 and its molecular mechanism; in vivo. To explore the effect and mechanism of GSK2334470 cooperative mTOR inhibitor PP242 inhibits myeloma cell growth and induce cell apoptosis. Methods: MTT detection of GSK2334470 and / or PP242 on multiple myeloma (multiply myeloma, MM) inhibited the growth of primary cells and leukemic cells; flow cytometry AnnexinV/PI method to detect cell apoptosis; Western blot detection of Caspase-3/8/9, PARP, expression of PI3K/PDK1/Akt/mTOR pathway related proteins. Construction of RPMI8226 cell tumor bearing mice model effect, detection of GSK2334470 and / or PP242 on the growth of mouse tumors. Results: 1.GSK2334470 could inhibit the growth of myeloma cell lines and primary MM patients Cell growth in a concentration dependent manner; no obvious toxic effect of the killing effect of.3.GSK2334470.2. of exogenous IL-6 and IGF-1 could not reverse the GSK2334470 of myeloma cells can induce the apoptosis of MM cell lines and primary cells of normal cell lines Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 and PARP are activated by.4.GSK2334470 inhibited PDK1 phosphorylation to regulate the PI3K/Akt/mTOR pathway and its downstream protein.5.GSK2334470 can cooperate with PP242 anti myeloma cell lines and primary cells, induced apoptosis of.6.PP242 cells through inhibition of mTORC2, downregulation of Akt 473rd sites of serine phosphorylation to enhance the anti myeloma effect of GSK2334470 completely inhibited the activity of.7.GSK2334470, Akt and mTORC1/C2 combined with PP242 can inhibit the tumor bearing. The growth of MM in mice, but the inhibitory effect of combined group was more obvious, the difference was statistically significant; the joint group of tumor mTO RC1 and mTORC2 activity was decreased. The second part is the research purpose of the importance of PTEN in the PDK1 inhibitor GSK2334470 anti myeloma effect: To study and compare the differences of four kinds of GSK2334470 MM cell killing effect and its relationship with PTEN gene by adenovirus or drugs; change of PTEN protein level in myeloma cells further confirmed the importance of PTEN in the GSK2334470 anti myeloma effects; research of GSK2334470 and proteasome inhibitor MG132 synergistic anti myeloma effect and its mechanism. Methods: the growth inhibition was detected by MTT assay; flow cytometry Annexin V/PI method to detect cell apoptosis; PCR and Western blot in MM cells was detected PTEN basal expression; adenovirus transfected MM cell line that over expression or low expression of PTEN; Western blot detection of intracellular PTEN, the expression of nuclear PTEN and PI3K/PDK1/Akt/mTOR pathway related proteins induced. The distribution of PTEN protein was detected by confocal light in the cells. Results: the lethal effect of 1.GSK2334470 on four kinds of myeloma cells was significantly different, more sensitive to ARP-1 and MM.1R; ARP-1, the percentage of apoptotic cells was significantly higher than that of RPMI8226 and MM.1R OPM-2; Cheng Zhengxiang.2. expression by adenovirus transfection MM cell line PTEN cell strain PTEN expression and sensitivity of.3.MG132 GSK2334470 can be altered by increasing the expression of PTEN in the cells, regulating PI3K/Akt/mTOR pathway and its downstream proteins, Co GSK2334470 killing myeloma cells, apoptosis induced by.4.GSK2334470 can make the high expression of MM cells in the cytoplasm of PTEN translocates to the nucleus, the other mechanism of GSK2334470 anti myeloma effects, molecular the mechanism of synergistic anti myeloma with MG132. Conclusion: GSK2334470 can inhibit the phosphorylation of PDK1 to regulate PI3K/Akt/mTOR pathway, induce myeloma cell apoptosis; mTO R inhibitor PP242 inhibit the phosphorylation of S473 mTORC2 and p-Akt GSK2334470 expression level of sensitivity and play synergistic anti myeloma effects of MM cells in.GSK2334470 PTEN; by proteasome inhibitor MG132 or adenovirus transfection increased the expression of PTEN in endothelial cells enhance the killing effect of GSK2334470; while GSK2334470 can also make the high expression of PTEN nuclear transfer, play the role of anti MM in coordination with the MG132. Suggesting that targeted inhibition of PDK1 and combined with mTOR inhibitors or proteasome inhibitors may be the treatment of multiple myeloma with new measures.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.3

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本文編號(hào)：1613305