本文選題：鼠巨細(xì)胞病毒　切入點(diǎn)：異基因造血干細(xì)胞移植　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)是β皰疹病毒家族的一員,在人群中的感染率高達(dá)50%,因而在近些年的病毒學(xué)研究中受到廣泛關(guān)注。對(duì)免疫功能正常的個(gè)體而言,CMV的原發(fā)感染通常表現(xiàn)為自限性,感染后宿主無(wú)明顯的疾病癥狀。然而,CMV感染后可以在這些宿主體內(nèi)建立伴隨終生的潛伏狀態(tài)。一旦這些宿主由于各種原因(例如接受器官移植、感染艾滋病的病毒等)導(dǎo)致免疫功能低下,潛伏狀態(tài)的CMV可以重新在體內(nèi)活化感染。目前針對(duì)CMV感染的常規(guī)藥物(例如更昔洛韋、膦甲酸鈉等)已在臨床應(yīng)用中證明了其可有效降低CMV的復(fù)制效率,但由于這些藥物使用后可能帶來(lái)的諸多副作用(包括血小板減少癥、嗜中性白血球減少癥以及細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)),其在實(shí)際臨床應(yīng)用中受到嚴(yán)格的限制。另外,關(guān)于給予患者長(zhǎng)期藥物治療后出現(xiàn)了具有耐藥性的CMV新病毒株的報(bào)道也日益增多。因此,在臨床異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)患者中若檢測(cè)到CMV的潛伏再活化,特別是當(dāng)其引發(fā)CMV病毒間質(zhì)性肺炎時(shí),如何優(yōu)化治療方案以降低移植受者的發(fā)病率和死亡率對(duì)醫(yī)務(wù)工作者提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前,已有相關(guān)研究設(shè)想并探索了大量與CMV潛伏和活化相關(guān)的可能因素。然而,已報(bào)道的影響病毒活化的證據(jù)之間存在矛盾,需要對(duì)其進(jìn)一步探索和驗(yàn)證,例如免疫抑制治療對(duì)allo-HSCT后患者體內(nèi)CMV活化有何影響。一方面,免疫抑制治療可能降低抗CMV特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答功能,進(jìn)而增加CMV活化風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)前的臨床移植方案中,通過(guò)各種措施促進(jìn)抗病毒免疫功能的盡早恢復(fù)仍是防治CMV最理想的方案。另一方面,大量證據(jù)證明,移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的發(fā)生和進(jìn)展(其同時(shí)也是免疫抑制療法的治療指征)與CMV活化緊密相關(guān),但目前尚不明確其中的機(jī)制。更重要的是,GVHD發(fā)生后會(huì)顯著升高的促炎癥因子之一——腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)作為一種啟動(dòng)CMV立即早期(immediate-early,IE)基因表達(dá)的重要因素已得到證明。因此,免疫抑制劑在allo-HSCT中對(duì)潛伏CMV的活化作用還需進(jìn)一步探索和研究。由于人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)所侵襲的宿主受到嚴(yán)格的種屬特異性所限制,大部分學(xué)者將鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,mcmv)作為hcmv體內(nèi)研究的重要工具。mcmv感染的小鼠已被證明是一種可替代hcmv臨床感染的可靠模型,并在大量cmv潛伏活化研究中使用,其在病毒的原發(fā)感染、潛伏建立、病毒再活化方面和hcmv臨床感染的表現(xiàn)和機(jī)制十分類似。在本研究中,本研究構(gòu)建了mcmv感染balb/c小鼠后潛伏和活化的動(dòng)物模型。在此基礎(chǔ)上,本研究分別探索了在并發(fā)輕微gvhd和并發(fā)嚴(yán)重gvhd的兩種allo-hsct小鼠模型中,免疫抑制劑對(duì)mcmv活化的作用。在所構(gòu)建的并發(fā)嚴(yán)重gvhd并且免疫功能恢復(fù)不佳的allo-hsct模型中,本研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制療法可以減輕mcmv的活化水平。隨后,本研究進(jìn)一步證明了這種免疫抑制劑帶來(lái)的抗病毒作用與降低的tnf-α水平有關(guān)。本研究的具體內(nèi)容和結(jié)果概括如下:1.mcmv病毒潛伏感染小鼠模型的建立和鑒定本研究探索了小鼠感染mcmv后體內(nèi)病毒的動(dòng)態(tài)變化。在擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的mcmv病毒后,研究人員對(duì)其滴度進(jìn)行了測(cè)定。隨后給予balb/c小鼠腹腔注射1×105pfumcmv,并在感染后14d、60d、180d分別處死3-4只,并留取其血液和肺組織。對(duì)全血進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量pcr(quantitativereal-timepcr,qpcr)結(jié)果顯示,感染后14d小鼠血液中存在極高載量的病毒,然而感染后60d及180d血液中已檢測(cè)不到病毒存在;通過(guò)半數(shù)細(xì)胞感染量(mediumtissuecultureinfectivedose,tcid50)方法檢測(cè)肺組織的病毒滴度,以及反轉(zhuǎn)錄pcr法(reversetranscriptionpcr,rt-pcr)檢測(cè)ie基因表達(dá),感染14d時(shí)可分別檢測(cè)到感染性病毒和ie基因表達(dá),而感染后60d及180d時(shí)均未檢測(cè)到。間接elisa實(shí)驗(yàn)提示,抗mcmv的igg抗體水平在移植后14d顯著升高,并在移植后60d及180d處于穩(wěn)定水平。研究人員在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將感染3-4wk小鼠1×105pfumcmv,并連續(xù)培育180d作為mcmv在小鼠體內(nèi)建立潛伏的標(biāo)準(zhǔn)。2.免疫抑制治療在并發(fā)輕微gvhd的allo-hsct小鼠模型中可促進(jìn)mcmv活化為避免gvhd的發(fā)生損傷移植后免疫功能的恢復(fù),本研究首先探討了在并發(fā)輕微gvhd的allo-hsct小鼠中免疫抑制劑對(duì)病毒活化的影響。潛伏mcmv的balb/c小鼠接受8.5gy輻照及1×107個(gè)c57bl/6小鼠骨髓細(xì)胞。后續(xù)免疫抑制治療中選用了2種臨床治療中常用的免疫抑制藥物:環(huán)孢素(cyclosporina,csa,商品名賽斯平)和雷帕霉素(rapamycin,rapa,商品名西羅莫司)。在移植后研究人員對(duì)3組小鼠(placebo組,csa組,rapa組)進(jìn)行了為期兩個(gè)月的觀察。由于骨髓細(xì)胞中僅含有少數(shù)的t淋巴細(xì)胞,所有小鼠在移植后均未出現(xiàn)明顯的gvhd反應(yīng),并且死亡率較低。移植56d后所有小鼠處死,隨后對(duì)病毒活化情況進(jìn)行了觀察,檢測(cè)指標(biāo)為小鼠14d、28d、42d、56d的血液mcmv載量及肺組織的mcmv滴度。結(jié)果顯示接受免疫抑制劑的小鼠其allo-hsct后病毒活化明顯高于對(duì)照組。本部分研究結(jié)果提示在并發(fā)輕微gvhd的allo-hsct小鼠模型中,免疫抑制治療可促進(jìn)潛伏小鼠體內(nèi)的mcmv病毒活化。3.免疫抑制劑在并發(fā)輕微gvhd的allo-hsct小鼠模型中強(qiáng)烈抑制宿主的抗mcmv免疫應(yīng)答本研究隨后對(duì)免疫抑制治療是否影響了免疫功能恢復(fù)進(jìn)而增強(qiáng)mcmv活化進(jìn)行了檢測(cè)。小鼠移植后血液嵌合pcr結(jié)果顯示,各組小鼠均可觀測(cè)到供鼠來(lái)源的血液細(xì)胞,表明移植物可在受鼠體內(nèi)長(zhǎng)期存在。移植后14、28、42、56d的血常規(guī)結(jié)果提示,在移植后一個(gè)月時(shí),經(jīng)免疫抑制劑處理小鼠的血象恢復(fù)有暫時(shí)性的延遲,然而在移植后第二個(gè)月,其血象水平已和安慰對(duì)照組小鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為進(jìn)一步觀測(cè)移植后小鼠免疫功能的恢復(fù)情況,本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)血液和脾中mcmv-cd8+t淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示給予免疫抑制劑處理后的小鼠不能產(chǎn)生足夠數(shù)量的mcmv-cd8+t淋巴細(xì)胞,提示免疫抑制劑的使用抑制了宿主的抗病毒免疫應(yīng)答。這解釋了免疫抑制療法如何在并發(fā)輕微gvhd的小鼠allo-hsct模型中增加mcmv活化風(fēng)險(xiǎn)。4.免疫抑制療法在并發(fā)嚴(yán)重gvhd的allo-hsct小鼠模型中抑制gvhd導(dǎo)致的損傷為建立并發(fā)嚴(yán)重gvhd的allo-hsct小鼠模型,本研究將移植的參數(shù)改良為7gy照射,并從潛伏mcmv的c57bl/6小鼠中移植1×107個(gè)骨髓細(xì)胞和1×107個(gè)脾細(xì)胞給予潛伏感染的balb/c受鼠。所有接受移植的小鼠共劃分為三組,分別接受csa、rapa以及安慰劑,劑量同上述模型一致,并對(duì)小鼠的生存率和gvhd評(píng)分進(jìn)行記錄。移植后對(duì)小鼠的觀察結(jié)果提示,無(wú)論是小鼠的一般狀態(tài)、生存率還是gvhd評(píng)分,免疫抑制劑(csa或rapa)均對(duì)小鼠的gvhd發(fā)生有明顯的抑制作用。在移植后28d研究人員處死所有小鼠,并留取樣本進(jìn)一步觀察gvhd的情況。腸道病理切片結(jié)果表明,對(duì)照組小鼠的腸道結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重,可觀察到腸絨毛削弱,黏膜結(jié)構(gòu)缺失等,與免疫抑制組樣品相比,gvhd損傷程度更高,各組切片的病理評(píng)分匯總后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。針對(duì)相關(guān)炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果顯示,接受免疫抑制治療的小鼠中tnf-α和白細(xì)胞介素2(interleukin-2,il-2)水平均明顯低于對(duì)照組,但γ干擾素(interferon-γ,ifn-γ)在各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上數(shù)據(jù)表明,在本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建體系中,免疫抑制劑的處理能夠降低移植后小鼠的gvhd損傷。5.并發(fā)嚴(yán)重gvhd的allo-hsct模型中小鼠的抗病毒免疫功能恢復(fù)匱乏本研究進(jìn)一步檢測(cè)了各組小鼠allo-hsct后的造血和免疫功能恢復(fù)情況。血液嵌合pcr結(jié)果顯示,所有小鼠在allo-hsct后28d時(shí)均檢測(cè)到了供鼠來(lái)源的血液細(xì)胞存在。血象結(jié)果提示各組小鼠的白細(xì)胞數(shù)回升緩慢,同時(shí)血液中幾乎檢測(cè)不到淋巴細(xì)胞存在。而針對(duì)特異性t淋巴細(xì)胞的流式檢測(cè)同樣說(shuō)明各組均未檢測(cè)到cmv-cd8+t淋巴細(xì)胞。這說(shuō)明在此模型中,gvhd嚴(yán)重地?fù)p傷了移植后小鼠總淋巴細(xì)胞的恢復(fù),進(jìn)而也顯著削弱抗病毒免疫應(yīng)答。gvhd(而非免疫抑制劑),導(dǎo)致了各組小鼠的抗mcmv特異性的免疫功能喪失,因而無(wú)論接受免疫抑制劑與否,各組小鼠的抗病毒免疫功能無(wú)明顯差異。6.免疫抑制治療在并發(fā)嚴(yán)重gvhd的allo-hsct小鼠模型中對(duì)mcmv活化有抑制作用在上述構(gòu)建的并發(fā)嚴(yán)重gvhd的allo-hsct小鼠模型中,本研究進(jìn)一步探索了免疫抑制劑與mcmv活化的關(guān)系,并發(fā)現(xiàn)免疫抑制組中小鼠的肺組織病毒滴度和血液中病毒拷貝數(shù)均明顯低于對(duì)照組小鼠,這表明免疫抑制劑在此模型中對(duì)mcmv的活化有抑制作用。7.免疫抑制治療可通過(guò)抑制tnf-α分泌進(jìn)而減輕mcmv活化本研究隨后對(duì)免疫抑制劑如何降低mcmv活化的機(jī)制進(jìn)行了探索。由于上述結(jié)果顯示2種促炎癥因子可能與mcmv的活化有關(guān),本研究分析了小鼠血漿中炎癥因子水平與血液中病毒載量的相關(guān)性。結(jié)果顯示活化的mcmv載量與tnf-α水平呈現(xiàn)明顯的正相關(guān),而mcmv活化與il-2未發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)。以上結(jié)果表明,tnf-α可能是導(dǎo)致mcmv活化的重要因素。為進(jìn)一步驗(yàn)證tnf-α在mcmv活化中的作用,本研究通過(guò)tnf-α分泌抑制劑——來(lái)那度胺(lenalidomide,len)重新設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)。本研究將所有小鼠劃分為4組,分別給予安慰劑(placebogroup),來(lái)那度胺聯(lián)合安慰劑(len+placebogroup),來(lái)那度胺聯(lián)合環(huán)孢素(len+csagroup),來(lái)那度胺聯(lián)合雷帕霉素(len+rapagroup),其他allo-hsct的參數(shù)和步驟與并發(fā)嚴(yán)重gvhd的allo-hsct小鼠模型一致。移植后28d,所有小鼠處死。隨后本研究對(duì)肺組織中的mcmv進(jìn)行了免疫組化檢測(cè),并對(duì)組化結(jié)果進(jìn)行了定量和評(píng)分,靶標(biāo)為病毒表面抗原糖蛋白b(murinecytomegalovirusglycoproteinb,mcmv-gb)。結(jié)果顯示接受來(lái)那度胺的三組(len+placebogroup,len+csagroup和len+rapagroup)小鼠的mcmv活化明顯低于僅接受安慰劑的小鼠(placebogroup),并且在接受來(lái)那度胺處理的三組小鼠之間,其mcmv活化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。針對(duì)血液中mcmv載量的qpcr結(jié)果與上述免疫組化結(jié)果一致。另外,elisa檢測(cè)驗(yàn)證了來(lái)那度胺的使用顯著降低了血漿中TNF-α的水平。這些結(jié)果表明,TNF-α是MCMV活化的關(guān)鍵調(diào)控因子,TNF-α分泌下降后MCMV的活化隨即減少。免疫抑制治療可通過(guò)抑制TNF-α分泌進(jìn)而減輕MCMV活化。總之,本研究表明,在allo-HSCT后免疫抑制劑的使用對(duì)MCMV活化有雙重的影響,特別是在并發(fā)嚴(yán)重GVHD的allo-HSCT小鼠模型中,免疫抑制劑通過(guò)減輕GVHD發(fā)展程度,降低TNF-α水平,進(jìn)而對(duì)MCMV活化起抑制作用。因此,本研究加深了人們對(duì)于免疫抑制劑與CMV活化之間關(guān)系的了解和認(rèn)識(shí),并為臨床中移植方案的選擇、抗病毒策略的制訂提供了新的依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R457.7;R511

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