本文選題：氫　切入點：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：一、研究背景心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,IR)使心肌細胞凋亡增加,導致再灌注后心功能不全,是制約心血管手術臨床療效的重要因素。如何有效地降低IR后心肌細胞凋亡,減少心肌損傷,保護心功能,一直都是心血管領域基礎和臨床研究的熱點。近來研究發(fā)現(xiàn),心肌IR時會引起嚴重的氧化應激,產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS),誘發(fā)氧化型鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ(ox-Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,ox-CaMKⅡ)激活,導致心肌細胞凋亡。心肌IR發(fā)生時,CaMKⅡ能夠介導細胞內(nèi)Ca~(2+)超載而加重心肌IR損傷。晚近有學者發(fā)現(xiàn)新型氣體分子氫(Hydrogen,H_2)可以在IR中選擇性抗氧化而發(fā)揮保護作用。我們推測,H_2可能通過減少心肌IR后ROS的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)ERS,降低CaMKⅡ的活化,減少細胞Ca~(2+)([Ca~(2+)]i),維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),從而抑制心肌細胞凋亡,發(fā)揮保護心功能的作用。二、研究目的1、明確分子氫在心肌IR損傷中的心肌保護作用;2、闡明分子氫在心肌IR中保護心肌的分子機制。三、研究方法(一)H_2調(diào)節(jié)ERS影響細胞凋亡的實驗研究乳鼠心肌細胞先經(jīng)低氧(1%氧氣+5%二氧化碳+94%氮氣)培養(yǎng)30min,然后正常(5%二氧化碳+95%空氣)培養(yǎng)120min,以建立細胞缺氧復氧(hypoxia/reoxygenation,HR)模型。實驗用細胞隨機分為3組:Con組、HR組和H_2組(先使用0.6m M富氫DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30min,再進行HR)。采用CCK-8測定心肌細胞活力,二硝基苯肼比色法測定培養(yǎng)液上清中LDH含量,ELISA法測定培養(yǎng)液上清中cTnI含量,流式細胞儀測定細胞凋亡率,以及Western blot檢測CHOP、Bcl-2和Bax蛋白的表達水平。(二)H_2調(diào)節(jié)ERS-CaMKⅡ-Ca~(2+)超載影響細胞凋亡機制研究1、CHOP介導H_2影響CaMKⅡ氧化激活的研究構(gòu)建大鼠CHOP基因過表達慢病毒載體(Lv-CHOP)和CHOP基因短發(fā)卡RNA(sh RNA)慢病毒載體(Lv-sh RNA),分別轉(zhuǎn)染乳鼠離體心肌細胞以上調(diào)或下調(diào)CHOP的表達水平。采用與第1部分相同方法構(gòu)建離體細胞HR模型。實驗用細胞隨機分為7組:Con組、HR組、H_2組、HR+Lv-CHOP組(采用Lv-CHOP轉(zhuǎn)染的細胞,處理同HR組)、HR+Lv-CHOP+H_2組(采用Lv-CHOP轉(zhuǎn)染的細胞,處理同H_2組)、HR+Lv-sh RNA組(采用Lv-sh RNA轉(zhuǎn)染的細胞,處理同HR組)和HR+Lv-sh RNA+H_2組(采用Lv-sh RNA轉(zhuǎn)染的細胞,處理同H_2組)。采用Western blot檢測ox-CaMKⅡ和CaMKⅡ蛋白的表達水平。2、CaMKⅡ介導H_2影響細胞內(nèi)Ca~(2+)超載的研究同第1部分方法建立離體心肌細胞HR模型,使用KN-93特異性阻滯CaMKⅡ激活。實驗用細胞隨機分成5組:Con組、HR組、H_2組、HR+KN-93組(細胞先在含2μM KN-93的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)30min,后處理同HR組)和HR+H_2+KN-93組(細胞先在含2μM KN-93的富氫DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)30min,后處理同HR組)。采用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)Ca~(2+)([Ca~(2+)]i)和細胞凋亡率,以及Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達水平。(三)H_2調(diào)節(jié)ERS影響細胞凋亡的在體驗證研究通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支缺血30min,隨后再通恢復灌注120min建立大鼠心肌IR模型。30只SD大鼠隨機分為3組:Sham組(只進行開胸手術)、IR組和H_2組(再灌注前5min給予腹腔注射10m L/kg富氫生理鹽水)。再灌注后120min測定大鼠的左心室收縮壓(LVSP)和左心室等容收縮期壓力最大變化速率(+dp/dtmax),Evans-Blue/TCC雙染色測定心肌梗死面積。采用免疫組織化學法測定心肌中8-OHd G和3-NT的陽性表達指數(shù),二硝基苯肼比色法測定血清中LDH含量,ELISA測定血清中c Tn I含量,TUNEL法檢測心肌細胞凋亡指數(shù),以及Western blot檢測CHOP、ox-CaMKⅡ、CaMKⅡ、Bcl-2、Bax蛋白表達水平。四、研究結(jié)果(一)H_2調(diào)節(jié)ERS影響細胞凋亡的實驗研究1、H_2改善心肌細胞HR后細胞活力各組心肌細胞的細胞活力分別為:Con 98.8±1.0%,HR 32.6±5.2%,H_2 59.3±3.9%,其中H_2組顯著高于HR組(P0.001),提示H_2可改善心肌細胞HR后細胞活力。2、H_2減少心肌細胞HR后損傷各組心肌細胞培養(yǎng)液上清中LDH含量分別為:Con 12.2±1.7 U/L,HR 24.7±3.1U/L,H_2 19.3±2.9 U/L,其中H_2組顯著低于HR組(P=0.047);各組培養(yǎng)液上清中c Tn I含量分別為:Con 68.2±8.8 ng/L,HR 127.8±16.6 ng/L,H_2 95.7±7.6 ng/L,其中H_2組顯著低于HR組(P=0.015),提示H_2可減少心肌細胞HR后損傷。3、H_2減少心肌細胞HR后細胞凋亡與Con組相比,HR組Bcl-2/Bax比值顯著降低(P0.001),而H_2組Bcl-2/Bax比值顯著高于HR組(P0.001),提示H_2在心肌細胞HR后可通過升高Bcl-2/Bax比值而減少細胞凋亡。各組心肌細胞凋亡率分別為:Con 7.7±1.6%,HR 87.7±9.0%,H_2 68.9±9.6%,其中H_2組顯著低于HR組(P=0.024),提示H_2可減少心肌細胞HR后細胞凋亡率。4、H_2影響心肌細胞HR后ERS,降低CHOP表達與Con組相比,HR組ERS相關蛋白CHOP表達顯著升高(P0.001),而H_2組CHOP表達顯著高于HR組(P0.001),提示H_2影響心肌細胞HR后ERS,降低CHOP表達水平。(二)H_2調(diào)節(jié)ERS-CaMKⅡ-Ca~(2+)超載影響細胞凋亡機制研究1、CHOP介導H_2對心肌細胞CaMKⅡ氧化激活水平的影響與Con組相比,HR組ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著升高(P0.001),而H_2組ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著低于HR組(P0.001),提示H_2可降低細胞HR后CaMKⅡ氧化激活(即ox-CaMKⅡ)水平。當上調(diào)CHOP表達(即HR+Lv-CHOP組),與HR組相比,ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著升高(P=0.002),在此基礎上再給予氫(即HR+Lv-CHOP+H_2組),與HR+Lv-CHOP組相比,ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值降低(P0.001),但與HR組之間無統(tǒng)計學差異(P=0.163);當下調(diào)CHOP表達(即HR+Lv-sh RNA組),與HR組相比,ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著降低(P0.001),在此基礎上再給予氫(即HR+Lv-sh RNA+H_2組),與HR+Lv-sh RNA組相比,oxCaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著降低(P0.001),且與H_2組無統(tǒng)計學差異(P=0.940),提示CHOP介導H_2對CaMKⅡ氧化激活水平的影響。2、CaMKⅡ介導H_2對心肌細胞[Ca~(2+)]i水平的影響與Con組相比,HR組[Ca~(2+)]i水平顯著升高(P0.001),而H_2組[Ca~(2+)]i水平顯著低于HR組(P0.001),提示H_2可降低細胞HR后[Ca~(2+)]i水平。當KN-93抑制CaMKⅡ激活(即HR+KN-93組),與HR組相比,[Ca~(2+)]i水平顯著降低(P0.001),在此基礎上再給予氫(即HR+KN-93+H_2組),與HR+KN-93組相比,[Ca~(2+)]i水平顯著降低(P=0.001),且與H_2組無統(tǒng)計學差異(P=0.143),提示CaMKⅡ介導H_2對[Ca~(2+)]i水平的影響。3、CaMKⅡ介導H_2對心肌細胞凋亡的影響與HR組相比,HR+KN-93組Bcl-2/Bax比值顯著升高(P=0.004),而HR+KN-93+H_2組Bcl-2/Bax比值顯著高于HR+KN-93組(P=0.030),且與H_2組無統(tǒng)計學差異(P=0.372),提示CaMKⅡ介導H_2對Bcl-2/Bax比值的影響。同樣地,與HR組相比,HR+KN-93組細胞凋亡率顯著降低(P0.001),而HR+KN-93+H_2組細胞凋亡率顯著低于HR+KN-93組(P0.001),且與H_2組無統(tǒng)計學差異(P=0.272),提示CaMKⅡ介導H_2對細胞凋亡率的影響。(三)H_2調(diào)節(jié)ERS影響細胞凋亡的在體驗證研究1、H_2減少心肌IR后羥自由基(·OH)和過氧亞硝基陰離子(ONOO-)反映·OH水平的8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHd G)在各組心肌中的陽性表達指數(shù)分別為:Sham 4.3±0.8%,IR 89.1±0.8%,H_2 54.9±5.0%,其中H_2組顯著低于IR組(P0.001);反映ONOO-水平的3-硝基酪氨酸(3-NT)在各組中的陽性表達指數(shù)分別為:Sham 9.7±0.8%,IR 86.7±5.2%,H_2 63.4±7.4%,同樣的,H_2組顯著低于IR組(P0.001),提示H_2減少心肌IR中·OH和ONOO-的含量。2、H_2影響心肌IR后ERS,降低CHOP表達與Sham組相比,IR組CHOP表達水平顯著升高(P0.001),而H_2組CHOP表達水平顯著低于IR組(P=0.001),證實H_2可調(diào)控ERS,降低心肌IR后CHOP表達。3、H_2降低心肌IR后CaMKⅡ氧化激活水平與Sham組相比,IR組ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著升高(P0.001),而H_2組ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著低于IR組(P0.001),證實H_2可降低心肌IR后CaMKⅡ氧化激活水平。4、H_2減少心肌IR后細胞凋亡與Sham組相比,IR組Bcl-2/Bax比值顯著降低(P0.001),而H_2組Bcl-2/Bax比值顯著高于IR組(P=0.003),證實H_2在心肌IR后可通過升高Bcl-2/Bax比值而減少細胞凋亡。各組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)分別為:Sham 4.6±1.1%,IR 42.7±5.7%,H_228.1±6.9%。其中H_2組顯著低于IR組(P=0.001),證實H_2可減少心肌IR后細胞凋亡數(shù)。5、H_2降低心肌IR后損傷各組大鼠血清中LDH含量分別為:Sham 2195.4±167.6 U/L,IR 4159.7±243.1 U/L,H_2 3699.4±182.7 U/L,其中H_2組顯著低于HR組(P=0.003);各組大鼠血清中c Tn I含量分別為:Sham 35.4±3.5 ng/L,IR 150.5±18.4 ng/L,H_2 121.6±13.8 ng/L,其中H_2組顯著低于HR組(P=0.005),證實H_2可減少心肌IR后損傷。6、H_2減少心肌IR后梗死面積與IR組相比,H_2組心肌梗死區(qū)面積/危險區(qū)面積(INF/AAR)顯著降低(22.4±2.9vs 48.4±3.5%,P0.001),證實H_2可減少心肌IR后梗死面積。7、H_2改善心肌IR后心功能體現(xiàn)左心室心肌收縮能力的LVSP和+dp/dtmax在IR組均顯著低于Sham組(92.4±6.3 vs 131.8±8.1 mm Hg,P0.001;3601.2±339.6 vs 8563.4±514.6 mm Hg/s,P0.001),而H_2組的LVSP和+dp/dtmax較IR組顯著提高(120.0±9.7 vs 92.4±6.3mm Hg,P0.001;5801.0±816.8 vs 3601.2±339.6 mm Hg/s,P0.001),證實H_2可改善心肌IR后左心室心肌收縮能力,保護心功能。五、研究結(jié)論1、心肌IR能激活ERS,增加心肌細胞的凋亡;2、H_2可通過減輕心肌IR后ERS,下調(diào)CHOP表達,降低CaMKⅡ的氧化激活,減少細胞凋亡;3、H_2影響心肌細胞凋亡的具體機制與CaMKⅡ介導細胞內(nèi)Ca~(2+)超載有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 周明宣,李鋒,吳穎,楊瑞芬;改良CHOP方案治療脾原發(fā)性惡性淋巴瘤7例[J];中國腫瘤臨床與康復;2000年06期

2 黃春暉;孫守金;謝鳳玲;;放療聯(lián)合CHOP(或類似方案)化療治療鼻腔非霍奇金淋巴瘤12例療效觀察[J];臨床醫(yī)藥實踐;2009年17期

3 林桐榆,管忠震,姜文奇,何友兼,徐光川,劉冬耕,黃慧強,滕小玉,徐瑞華;標準的和2周一療程CHOP方案治療進展型非霍奇金氏淋巴瘤的隨機對照研究[J];癌癥;1999年06期

4 馬一蓋,徐韶華;CHOP為主的化療方案治療中高度惡性非霍奇金淋巴瘤療效評價[J];白血病.淋巴瘤;2001年06期

5 盧岑,張國安,肖寧新;結(jié)外非霍奇金氏淋巴瘤18例臨床分析和CHOP方案療效觀察[J];宜春學院學報;2001年02期

6 劉金宏,卞詠梅;CHOP聯(lián)合α-干擾素治療中度惡性非霍奇金淋巴瘤的療效研究[J];中國全科醫(yī)學;2002年06期

7 阮春慧,孫曉紅;改良式CHOP方案治療非霍奇金氏淋巴瘤24例療效觀察[J];腫瘤防治雜志;2003年10期

8 陳鵬;李麗慶;張愛蓮;梁艷;黃純;;α-2b干擾素聯(lián)合CHOP方案治療52例侵襲性非霍奇金淋巴瘤臨床觀察[J];中國腫瘤臨床;2006年13期

9 ;Rituximab in Combination with CHOP, an Effective and Well-tolerated Salvage Regimen for Diffuse Large B-Cell Lymphoma[J];Chinese Journal of Clinical Oncology;2007年04期

10 ;Observation of the Curative Effect of Mabthera in Combination with the CHOP Regimen in Treating Invasive B-Cell Lymphoma:A Report of 45 Cases[J];Chinese Journal of Clinical Oncology;2008年03期

相關會議論文 前10條

1 ;The Effect of Endoplasmic Reticulum Stress Protein CHOP on Cyclosporine A-induced Injury of Glomerular Endothelial Cells[A];第八屆海峽兩岸心血管科學研討會論文集[C];2011年

2 ;Recent Advances in the Management of Aggressive Lymphomas[A];第十次全國淋巴瘤學術會議論文匯編[C];2007年

3 王曉雪;李艷;;美羅華聯(lián)合CHOP方案與CHOP方案治療Ⅲ、Ⅳ期彌漫大B細胞性淋巴瘤的臨床對比研究[A];全國中西醫(yī)結(jié)合血液學學術會議論文匯編[C];2010年

4 鄭翠萍;張衛(wèi)平;徐杰;;CHOP-VP_(16)方案治療非何杰金淋巴瘤的臨床分析[A];2005年浙江省腫瘤學術會議全國大腸癌轉(zhuǎn)移與復發(fā)的診治研討會學術論文集[C];2005年

5 楊坤禹;;New Advances in the Management of B Cell Lymphoma[A];第23屆湖北省腫瘤學術大會會議資料[C];2013年

6 鄒文蓉;彭鵬;王瑜;;雙周CHOP方案治療彌漫大B細胞淋巴瘤的臨床研究[A];第一屆全國難治性淋巴瘤學術研討會暨第二屆全國多發(fā)性骨髓瘤學術研討會（國家級血液系統(tǒng)惡性腫瘤繼續(xù)醫(yī)學教育學習班）繼續(xù)教育集[C];2007年

7 楊建良;劉尚梅;何小慧;董梅;周生余;劉鵬;張長弓;秦燕;桂琳;楊晟;孫燕;石遠凱;;利妥昔單抗加入CHOP方案可改善療效——60例濾泡性3級淋巴瘤生存和預后因素分析[A];中國腫瘤內(nèi)科進展 中國腫瘤醫(yī)師教育（2014）[C];2014年

8 王金萬;馬軍;;羅擾素(Roferon-A)聯(lián)合CHOP方案與單用CHOP方案治療非霍奇金氏淋巴瘤的隨機對照研究(CSCO Protocol NO 9805)[A];中國臨床腫瘤學教育專輯（2001）——中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學協(xié)作中心（CSCO）第五屆年會論文集[C];2001年

9 尤安磊;張秀花;周新強;馮淑嫻;;CHOP方案聯(lián)合干擾素治療NHL22例臨床觀察[A];第十次全國淋巴瘤學術會議論文匯編[C];2007年

10 劉廣博;蘇玲;劉相國;;ATF4-ATF3-CHOP通路調(diào)控DR5誘導腫瘤細胞凋亡[A];“細胞活動 生命活力”——中國細胞生物學學會全體會員代表大會暨第十二次學術大會論文摘要集[C];2011年

相關重要報紙文章 前3條

1 劉元江;利妥昔單抗聯(lián)合CHOP治療彌漫大B細胞淋巴瘤的成本－效果分析[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

2 駐京記者 賈巖;治療年輕DLBCL患者,哪種方案好[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2010年

3 譯 丁香;R—CHOP聯(lián)合利妥昔單抗對外套細胞淋巴癌老年患者有效[N];中國醫(yī)藥報;2012年

相關博士學位論文 前7條

1 王立奎;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應在異丙酚神經(jīng)保護中的作用[D];安徽醫(yī)科大學;2014年

2 張盟;CHOP基因敲除后抑制UUO誘導的小鼠腎臟纖維化的機制研究[D];華中科技大學;2016年

3 李偉;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-CHOP-CaMKⅡ通路介導分子氫心肌保護作用的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2017年

4 董彪;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子CHOP在腎臟缺血再灌注損傷中的作用和機制研究[D];吉林大學;2014年

5 向華;黏液型/圓細胞型脂肪肉瘤FUS-CHOP融合基因及其診斷價值的研究[D];復旦大學;2005年

6 張亞妮;Zhangfei基因在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應中的生物功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2010年

7 曲鵬;NGF和CGRP對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元P38MAPK，CHOP及IL-1β表達的調(diào)節(jié)作用[D];中國醫(yī)科大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 朱瓊花;以CHOP為靶點的新型抗腫瘤藥物的高通量篩選及機制研究[D];浙江大學;2009年

2 黃嘯元;GRP78及CHOP在SAH后神經(jīng)元細胞凋亡中作用的研究[D];石河子大學;2015年

3 申英花;阿奇霉素對高氧肺損傷新生大鼠CHOP及GRP78表達的影響[D];延邊大學;2015年

4 張坤;TTF1-NP通過活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激CHOP通路抑制大鼠原發(fā)性肝癌的生長[D];延邊大學;2015年

5 熊佑禎;R-CHOP方案應用于成年男女DLBCL患者的療效比較[D];山東大學;2015年

6 朱小娟;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子CHOP在賁門癌中的作用機制及臨床研究[D];河南科技大學;2015年

7 李楊;大鼠重癥急性胰腺炎引起肝損傷過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關分子GRP78及CHOP的表達變化[D];華北理工大學;2015年

8 代永鑫;慢性低灌注誘導海馬PERK-ATF4-CHOP/JNK-cJun信號通路及雌激素的干預[D];華北理工大學;2015年

9 周揚;生發(fā)中心和非生發(fā)中心彌漫大B細胞淋巴瘤的療效影響因素分析[D];青島大學;2015年

10 池俊杰;CHOP在糖尿病大鼠膀胱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用研究[D];山西醫(yī)科大學;2016年

，

本文編號：1567967