發(fā)布時間：2018-02-26 10:20

  本文關(guān)鍵詞： 線粒體自噬 熱休克蛋白27 氧化應(yīng)激　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景由于當今社會正朝著老齡化社會不斷演變,因此關(guān)注老齡化相關(guān)疾病的研究顯得格外重要。心血管循環(huán)系統(tǒng)是維持人體正常生命活動的重要組成部分,然而心臟的再生能力十分有限,隨著年齡的增長,心臟的收縮舒張功能逐漸衰退,這使得心臟逐漸難以維持其正常的泵血功能。因此,延長心臟衰老,維持心臟收縮舒張的泵血功能成為一個十分有意義的研究方向。研究表明,心臟衰老的發(fā)病機制涉及多個分子機制,包括氧化應(yīng)激、自噬障礙,代謝變化,鈣平衡調(diào)節(jié)障礙,和神經(jīng)內(nèi)分泌通路的激活等。心肌細胞終末分化的性質(zhì)使得這些細胞內(nèi)受損的大分子和細胞器特別容易積累,這就意味著需要增加自噬的激活來清理這些有害細胞的"垃圾",以維持細胞的穩(wěn)態(tài)。不幸的是,心肌細胞自噬活性隨著年齡的增長而下降,而細胞自噬的受損具有多重不良后果,包括降低心臟收縮功能和增加心律失常的風(fēng)險等。隨著年齡的增長,心臟中活性氧(reactive oxygen species ROS)的含量也隨之增加,老化的心肌細胞內(nèi)的ROS主要由受損的線粒體所產(chǎn)生的,與此同時ROS的異常蓄積亦會引起線粒體損傷,最終導(dǎo)致細胞的凋亡。由此可見線粒體是ROS生成的主要來源細胞器同時也是ROS攻擊的靶細胞器。由于心肌細胞對線粒體能量代謝的高度依賴性,使得心臟在整個生命周期內(nèi)都暴露在ROS的高負荷中。所以在一定程度下清除ROS,即抗氧化作用是延緩心臟衰老的有效措施。線粒體自噬是一個高度選擇的自噬過程,可以促進清除功能障礙或不必要的線粒體。PINK1-Parkin通路是當下研究中較為受到關(guān)注的線粒體自噬途徑。當線粒體膜電位消失,則導(dǎo)致PINK1穩(wěn)定地在線粒體外膜存在,之后則會促進胞內(nèi)E3泛素連接酶Parkin的招募和激活。激活的Parkin可以介導(dǎo)功能障礙的線粒體被自噬體吞噬以進而被選擇性消除。因而通過激活PINK1和Parkin的線粒體自噬可以防止受損線粒體對心肌細胞進一步損傷,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而延緩心臟衰老。熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一類生物體中組織結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白質(zhì),細胞可以由內(nèi)源或者外源性應(yīng)激源的刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生。熱休克蛋白27(HSP27)是一種廣泛表達于哺乳動物的小熱休克蛋白亞家族的成員,在人類,其分子量為27kDa,在嚙齒類動物中,其分子量為25kDa。HSP27除了在細胞分子水平上使錯誤結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)完成正確的折疊和組裝,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)細胞的增殖,分化,凋亡外,還參與了組織在氧化應(yīng)激、熱休克反應(yīng)、缺氧/缺血損傷等的調(diào)控。我們研究組和其他研究人員均發(fā)現(xiàn)高表達HSP27可以對抗缺血/再灌注損傷,心肌梗死,炎癥反應(yīng),以及阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷,心功能障礙。HSP27對心臟保護的機制涉及抗氧化能力,抑制炎癥反應(yīng),提高心肌細胞的存活率,以及自噬激活和提高線粒體活性等。因此,我們提出研究假設(shè):高表達HSP27可以延緩由增齡引起的心臟衰老。目的在本項研究中,我們通過構(gòu)建在心臟特異表達HSP27的轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg),同時選取年齡與之相匹配的野生型小鼠(WT)作為衰老模型的研究對象來探索HSP27對由年齡誘導(dǎo)的心臟衰老的作用及其可能涉及的機制。研究方法和內(nèi)容1.實驗動物的構(gòu)建在南京大學(xué)動物模式所的協(xié)助下,構(gòu)建心肌特異性表達的HSP27轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg),本研究以飼養(yǎng)2年(24個月)的Tg小鼠和性別,年齡與之相匹配的野生型小鼠(WT)作為衰老模型的研究對象。本實驗的實驗動物護理和實驗報告均得到了南京大學(xué)動物保護委員會的批準。所有實驗均遵守關(guān)于動物倫理使用的國際準則。2.小鼠心功能的檢測通過Vevo770設(shè)備對小鼠進行超聲心動圖測量。在超聲心動圖測量時,2個月月齡的Tg小鼠和性別相匹配的WT小鼠作為青年對照組。通過M-mode型超聲評價小鼠射血分數(shù)等心功能指標,或著通過脈沖多普勒評價二尖瓣功能。最終的實驗數(shù)據(jù)為至少連續(xù)五個心動周期的平均值。3.馬松三色染色將心臟組織收集后,用4%多聚甲醛過夜固定,之后用石蠟包埋,在乳頭肌水平制作成石蠟切片。馬松三色染色法是用來了解心臟纖維化程度的方法。染色后的片子在放大400 x的顯微鏡下觀察,通過計算心室中心肌內(nèi)纖維化的面積比例來評價小鼠心肌纖維化的程度。4.組織免疫熒光收集好小鼠心臟組織標本,用4%多聚甲醛過夜固定,之后用石蠟包埋組織制作成切片后,將切片進行脫蠟、水化,抗原修復(fù)和封閉。隨后,將切片上的組織與適當?shù)囊豢乖?℃孵育過夜,第二天選用FITC(綠色熒光)或者Cy3(紅色熒光)標記的二抗在37℃孵育60min。用α-actinin來表示心肌細胞。用Hoechst 33342對細胞核進行復(fù)染。染色后切片的觀察和圖像的采集通過熒光顯微鏡來完成。5.DCFH檢測通過熒光指示劑DCFH來測定ROS水平。當把DCFH加到組織勻漿中,勻漿中ROS會使得DCFH氧化,生產(chǎn)熒光的DCF。將1uM的DCFH和1毫升含10ug心肌胞漿蛋白一起孵育1h后,使用900Hi型全自動恒溫酶標儀在485 nm的激發(fā)波長和535 nm的發(fā)射波長下進行檢測。6.蛋白羰基化實驗將心室組織在(蔗糖0.3M,煙堿0.03M和EDTA 0.02M,pH 7.4)液體里勻漿,之后將組織勻漿液在4℃離心機中以10000g離心5 min。每500ul體積中含100ug的胞漿蛋白,和2mM的DNPH常溫避光孵育1h。最后將DNPH處理的蛋白,采用Western blot的方法檢測蛋白質(zhì)的羰基化反應(yīng)。7.蛋白質(zhì)印跡收集24個月大的老齡小鼠心臟,提取蛋白通過Western blot的方法檢測p16,p53,LC3,p62,PINK1,Parkin等蛋白水平。GAPDH作為蛋白質(zhì)印跡的內(nèi)參,每組n=3。8.統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。組間比較采用t檢驗或者單因素方差分析,數(shù)據(jù)運用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果1.HSP27減輕由年齡引起的心臟衰老1.1心肌特異性表達HSP27的鑒定我們成功構(gòu)建心肌特異性表達人HSP27基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,通過Western blot分析來確認,在Tg小鼠心臟中HSP27表達豐富,而野生型對照組中則不表達(HSP27抗體不與小鼠的HSP25交叉反應(yīng))。1.2 HSP27對衰老心臟心功能的影響與年輕的WT小鼠相比,老年的WT小鼠的E/A比值減少37.5%,EF(40.0%)和FS(45.9%)明顯下降,與此同時LVVd(67.4%)和LVVs(181.0%)明顯增加(P0.01)。與年輕的Tg小鼠相比,老年Tg小鼠的E/A比值減少15.4%(P0.05),而老年Tg小鼠的EF,FS,和LVVd較年輕Tg小鼠相比變化不大。但是,與老齡WT小鼠相比,老齡Tg小鼠減緩(37.4%)由于年齡引起的E/A比值減少(P0.05),高齡Tg小鼠較WT小鼠EF、FS明顯增加,同時LVVd 和 LVVs 明顯降低(P0.01)。2.HSP27減少老年小鼠心肌中衰老標志物的水平在小鼠心肌組織中,與老年WT小鼠相比,老年Tg小鼠的p16和p53的水平分別顯著降低46.5%和49.4%(P0.01),老年Tg小鼠的p21表達水平比WT老年小鼠心肌中p21的表達水平顯著降低(P0.01)。為了確定p53的激活,我們繼續(xù)探究在Ser15位點磷酸化的p53磷酸化水平(p-p53)。在老齡Tg小鼠心臟的p-p53水平比老齡WT小鼠心肌組織中的p-p53明顯降低(P0.01)。3.HSP27減緩老年小鼠心肌間質(zhì)的纖維化進程與老齡WT小鼠心臟心肌間質(zhì)相比,老年Tg小鼠心臟心肌間質(zhì)纖維化明顯減少 76.2%(P0.01)。4.HSP27減少老年小鼠心肌中ROS的含量在老齡的WT小鼠和Tg小鼠的心臟中ROS含量分別為2038.6和752.4個單位,老年Tg小鼠的心臟中ROS含量比老年的WT小鼠顯著降低(P0.01)。同時,老齡Tg小鼠心肌的蛋白質(zhì)羰基化水平(46.1%)明顯較老齡的WT小鼠降低(P0.01)5.HSP27提高老齡小鼠心臟中的自噬水平與老齡WT小鼠心臟相比,老年Tg小鼠心臟的LC3-II蛋白水平明顯降低38.7%(P0.01),p62蛋白表達水平降低59%(P0.01)。同時老齡Tg小鼠心臟中參與自噬體形成和成熟的蛋白表達水平較WT高齡小鼠顯著增加:Atg13(112.7%)、Vps34(68.5%)、和 Rab7(138.4%)(P0.01)。6.HSP27減少泛素結(jié)合蛋白的含量高齡的Tg小鼠心臟的蛋白質(zhì)的泛素化水平(76.2%)比高齡的WT小鼠顯著降低(P0.01)。7.HSP27增加PINK1和Parkin在老齡心臟中的表達水平與老齡的WT小鼠心臟相比,老齡Tg小鼠心臟中PINK1和Parkin的表達水平分別增加了 57.1%和60.5%(P0.01),高齡Tg小鼠心臟中BNIP3表達水平明顯高于高齡WT小鼠(P0.05)。而Nix蛋白的水平在兩組基因型不同的高齡小鼠中表達相差不大。結(jié)論HSP27可以改善高齡化引起的心臟功能下降,其保護機制涉及抗氧化和線粒體自噬的激活。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：1537603