本文關(guān)鍵詞： CAI 結(jié)腸炎 DSS THP-1 NF-κB NLRP3 炎癥體　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景與目的自身免疫性疾病炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)和克羅恩病(Crohn's disease)的統(tǒng)稱,其病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確[1]。近幾年來基礎(chǔ)以及臨床研究表明,炎性細(xì)胞因子如TNF-α等的升高與自身免疫性疾病炎癥性腸病密切相關(guān),已有大量的實(shí)驗(yàn)室和臨床資料證明,TNF-α抑制劑對(duì)上述疾病都可能有一定的療效。這就使得TNF-α抑制劑成為新藥研究和發(fā)展的新熱點(diǎn)。到目前為止,已經(jīng)得到批準(zhǔn)的TNF-α抑制劑(TNF-α單抗和可溶性TNF-α受體)都是生物制品。雖然它們的療效已經(jīng)得到證實(shí)。但也存在不少缺陷。例如,作為蛋白制劑需注射給藥,而且長期使用會(huì)產(chǎn)生抗體及相關(guān)的問題,其價(jià)格也尤為昂貴。因此探索治療自身免疫疾病的抗炎性細(xì)胞因子藥物的研發(fā),尋找可以口服的、低制造成本的小分子化學(xué)合成藥物,已經(jīng)成為全球新藥研發(fā)方向羧胺三唑(Carboxyamidotriazole,CAI)是一種正處于臨床前實(shí)驗(yàn)中的非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物,其可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制血管生成。近年來,我們課題組發(fā)現(xiàn)羧胺三唑?qū)σ恍┘�、慢性炎癥模型表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗炎效果。尤其是對(duì)動(dòng)物模型中的一些抗炎因子有較強(qiáng)的抑制作用,包括IL-1β、TNF-α、IL-6等在IBD中起著重要作用的炎癥因子,那么CAI是否對(duì)IBD也有作用?其作用機(jī)理是否與細(xì)胞因子的過度表達(dá)以及NF-κB信號(hào)通路和NLRP3炎癥體的活化關(guān)系密切?因此我們建立了相關(guān)的動(dòng)物和細(xì)胞模型,來進(jìn)一步探討其藥理作用及和可能的作用機(jī)制。研究方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)急性小鼠結(jié)腸炎模型,對(duì)小鼠的體重、糞便形狀、便血程度等進(jìn)行DAI(疾病活動(dòng)指數(shù))評(píng)分、結(jié)腸組織的病理病變情況進(jìn)行大體評(píng)分、對(duì)結(jié)腸組織的病理切片進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分、檢測血清和組織中與炎癥相關(guān)及腸道病變的一系列標(biāo)志物(MPO、Lipocalin-2和FITC熒光強(qiáng)度)來評(píng)價(jià)藥物的治療效果。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測造模和給藥7天后動(dòng)物結(jié)腸組織中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌水平,包括IL-lβ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β的水平。采用Western blot和免疫組織化學(xué)染色法檢測NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,包括NF-κBp65、IκBα和磷酸化IκBα。采用q-PCR法檢測NLRP3炎癥體(包括NLRP3、ASC和caspase-1)的mRNA水平,采用采用Western blot和免疫組織化學(xué)染色法檢測NLRP3炎癥體相關(guān)的各蛋白在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平,包括 NLRP3、ASC、pro-caspase-1 和 caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的前體與成熟體蛋白。體外實(shí)驗(yàn)我們選用了研究炎癥常用的THP-1急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株,PMA對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)使其成為巨噬細(xì)胞后,使用脂多糖(LPS)對(duì)其進(jìn)行刺激使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測LPS刺激后細(xì)胞上清中TNF-α、IL-lβ和IL-18等炎癥因子的水平,評(píng)價(jià)模型是否建立成功以及羥胺三唑是否在細(xì)胞水平上抑制炎癥因子的產(chǎn)生。采用Western blot法檢測NF-κB信號(hào)通路和NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,包括IκBα和磷酸化IκBα,NLRP3、ASC、pro-caspase-1和caspase-1。通過上述在細(xì)胞水平的檢測來印證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)關(guān)于藥物作用途徑的猜想和假設(shè)。研究結(jié)果1.2%DSS持續(xù)給藥7天可成功誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型。其病理表現(xiàn)主要為大腸縮短,腸壁變薄,腸道通透性變高,黏膜顯著充血水腫,散在性糜爛或潰瘍伴出血,黏膜炎癥細(xì)胞浸潤,隱窩膿腫及杯狀細(xì)胞消失或減少等。2.CAI對(duì)由結(jié)腸炎引起的動(dòng)物的體重減輕情況有顯著改善,并可以降低DAI評(píng)分。3.CAI中、高劑量組對(duì)動(dòng)物結(jié)腸組織的病理改變明顯減輕。4.CAI對(duì)結(jié)腸炎的組織和血清中相關(guān)炎癥標(biāo)記物MPO活性有明顯降低作用,還可使腸道通透性下降,Lipocalin-2水平下降,表明其對(duì)于炎癥有緩解作用。5.病理切片H.E染色結(jié)果顯示,給予中、高劑量CAI后,小鼠結(jié)腸黏膜損傷累及的范圍減小,杯狀細(xì)胞缺失程度和隱窩結(jié)構(gòu)破壞程度減輕,中性粒細(xì)胞浸潤減少。6.使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測動(dòng)物組織中炎癥因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β)的水平,給予CAI后均有不同程度的降低,特別是CAI高劑量組與造模組相比均有顯著性差異。7.Western blot法檢測發(fā)現(xiàn),給予造模劑后IL-1β和IL-18蛋白的前體和成熟體的表達(dá)顯著升高,而給予CAI后,對(duì)四種蛋白的表達(dá)均有抑制作用。8.免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示,CAI可以顯著降低NF-κB p65在細(xì)胞核中的表達(dá),同時(shí)胞漿中的染色程度也比較淺。而造模組的NF-κB p65在細(xì)胞核中的表達(dá)與Normal組相比顯著升高。9.Western blot法檢測發(fā)現(xiàn),CAI可以明顯抑制造模劑引起的動(dòng)物結(jié)腸組織中IκBα的降解以及磷酸化`κBα含量的升高。10.q-PCR的結(jié)果顯示,NLRP3和caspase-1的mRNA水平在給予CAI之后相比造模組顯著降低,而ASC的mRNA水平在各組間無明顯差異。11.Western blot和免疫組織化學(xué)染色方法檢測的結(jié)果均顯示,小鼠結(jié)腸組織中NLRP3和caspase-1的蛋白表達(dá)水平在給予CAI之后,有顯著的下調(diào)。而ASC的表達(dá)在各組間無明顯差異。12.使用CCK-8法和SRB法檢測細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn),羧胺三唑?qū)τ赥HP-1細(xì)胞沒有明顯的抑制增殖的毒性作用。13.羧胺三唑?qū)τ贚PS刺激的分化的THP-1細(xì)胞中高表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-18具有顯著的降低其分泌的作用。14.使用Western blot方法檢測LPS刺激的分化的THP-1細(xì)胞中p-IκBα和IκBα的蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)CAI可以抑制IκBα的磷酸化,高劑量的CAI還可以抑制IκBα的降解。15.使用Western blot方法檢測LPS刺激的分化的THP-1細(xì)胞中NLRP3相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)CAI可以抑制NLRP3蛋白的表達(dá)和caspase-1的活化,而ASC在各組之間無明顯差異。結(jié)論CAI能夠明顯改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、食物消耗量、臨床評(píng)分、宏觀評(píng)分和組織學(xué)評(píng)分等情況。同時(shí)明顯減輕動(dòng)物結(jié)腸充血、腸壁變薄的情況,減小黏膜缺損區(qū);組織學(xué)觀察可見黏膜損害累及的結(jié)腸范圍縮小,毛細(xì)血管擴(kuò)張、淋巴濾泡增生、黏膜下層水腫和隱窩結(jié)構(gòu)破壞程度明顯減輕。CAI能顯著降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸勻漿中MPO的活性;顯著降低結(jié)腸炎小鼠血清中Linpocalin-2的含量;對(duì)維持腸道完整性有明顯的保護(hù)作用。對(duì)結(jié)腸勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18等細(xì)胞因子水平具有明顯抑制作用,且明顯下調(diào)結(jié)腸組織中NF-κB p65核轉(zhuǎn)位水平。其可能是通過NF-κB和NLRP3炎癥體通路發(fā)揮作用。表明CAI對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎具有良好的治療作用,其藥效發(fā)揮的作用機(jī)制可能與其抑制NF-κB和NLRP3炎癥體的激活,進(jìn)而降低炎癥組織中升高的TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性細(xì)胞因子的水平有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

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