本文關鍵詞： CAI 結腸炎 DSS THP-1 NF-κB NLRP3 炎癥體　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景與目的自身免疫性疾病炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)和克羅恩病(Crohn's disease)的統(tǒng)稱,其病因及發(fā)病機制至今尚未完全明確[1]。近幾年來基礎以及臨床研究表明,炎性細胞因子如TNF-α等的升高與自身免疫性疾病炎癥性腸病密切相關,已有大量的實驗室和臨床資料證明,TNF-α抑制劑對上述疾病都可能有一定的療效。這就使得TNF-α抑制劑成為新藥研究和發(fā)展的新熱點。到目前為止,已經(jīng)得到批準的TNF-α抑制劑(TNF-α單抗和可溶性TNF-α受體)都是生物制品。雖然它們的療效已經(jīng)得到證實。但也存在不少缺陷。例如,作為蛋白制劑需注射給藥,而且長期使用會產(chǎn)生抗體及相關的問題,其價格也尤為昂貴。因此探索治療自身免疫疾病的抗炎性細胞因子藥物的研發(fā),尋找可以口服的、低制造成本的小分子化學合成藥物,已經(jīng)成為全球新藥研發(fā)方向羧胺三唑(Carboxyamidotriazole,CAI)是一種正處于臨床前實驗中的非細胞毒性抗腫瘤藥物,其可以抑制腫瘤細胞增殖,誘導腫瘤細胞凋亡和抑制血管生成。近年來,我們課題組發(fā)現(xiàn)羧胺三唑?qū)σ恍┘�、慢性炎癥模型表現(xiàn)出了較強的抗炎效果。尤其是對動物模型中的一些抗炎因子有較強的抑制作用,包括IL-1β、TNF-α、IL-6等在IBD中起著重要作用的炎癥因子,那么CAI是否對IBD也有作用?其作用機理是否與細胞因子的過度表達以及NF-κB信號通路和NLRP3炎癥體的活化關系密切?因此我們建立了相關的動物和細胞模型,來進一步探討其藥理作用及和可能的作用機制。研究方法體內(nèi)實驗主要是采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導急性小鼠結腸炎模型,對小鼠的體重、糞便形狀、便血程度等進行DAI(疾病活動指數(shù))評分、結腸組織的病理病變情況進行大體評分、對結腸組織的病理切片進行組織學評分、檢測血清和組織中與炎癥相關及腸道病變的一系列標志物(MPO、Lipocalin-2和FITC熒光強度)來評價藥物的治療效果。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測造模和給藥7天后動物結腸組織中相關細胞因子的表達和分泌水平,包括IL-lβ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β的水平。采用Western blot和免疫組織化學染色法檢測NF-κB信號通路相關蛋白的表達水平,包括NF-κBp65、IκBα和磷酸化IκBα。采用q-PCR法檢測NLRP3炎癥體(包括NLRP3、ASC和caspase-1)的mRNA水平,采用采用Western blot和免疫組織化學染色法檢測NLRP3炎癥體相關的各蛋白在結腸組織中的表達水平,包括 NLRP3、ASC、pro-caspase-1 和 caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的前體與成熟體蛋白。體外實驗我們選用了研究炎癥常用的THP-1急性粒細胞白血病細胞株,PMA對其進行誘導使其成為巨噬細胞后,使用脂多糖(LPS)對其進行刺激使其產(chǎn)生炎癥反應。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測LPS刺激后細胞上清中TNF-α、IL-lβ和IL-18等炎癥因子的水平,評價模型是否建立成功以及羥胺三唑是否在細胞水平上抑制炎癥因子的產(chǎn)生。采用Western blot法檢測NF-κB信號通路和NLRP3炎癥體相關蛋白的表達水平,包括IκBα和磷酸化IκBα,NLRP3、ASC、pro-caspase-1和caspase-1。通過上述在細胞水平的檢測來印證動物實驗關于藥物作用途徑的猜想和假設。研究結果1.2%DSS持續(xù)給藥7天可成功誘導小鼠急性結腸炎模型。其病理表現(xiàn)主要為大腸縮短,腸壁變薄,腸道通透性變高,黏膜顯著充血水腫,散在性糜爛或潰瘍伴出血,黏膜炎癥細胞浸潤,隱窩膿腫及杯狀細胞消失或減少等。2.CAI對由結腸炎引起的動物的體重減輕情況有顯著改善,并可以降低DAI評分。3.CAI中、高劑量組對動物結腸組織的病理改變明顯減輕。4.CAI對結腸炎的組織和血清中相關炎癥標記物MPO活性有明顯降低作用,還可使腸道通透性下降,Lipocalin-2水平下降,表明其對于炎癥有緩解作用。5.病理切片H.E染色結果顯示,給予中、高劑量CAI后,小鼠結腸黏膜損傷累及的范圍減小,杯狀細胞缺失程度和隱窩結構破壞程度減輕,中性粒細胞浸潤減少。6.使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測動物組織中炎癥因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β)的水平,給予CAI后均有不同程度的降低,特別是CAI高劑量組與造模組相比均有顯著性差異。7.Western blot法檢測發(fā)現(xiàn),給予造模劑后IL-1β和IL-18蛋白的前體和成熟體的表達顯著升高,而給予CAI后,對四種蛋白的表達均有抑制作用。8.免疫組織化學染色的結果顯示,CAI可以顯著降低NF-κB p65在細胞核中的表達,同時胞漿中的染色程度也比較淺。而造模組的NF-κB p65在細胞核中的表達與Normal組相比顯著升高。9.Western blot法檢測發(fā)現(xiàn),CAI可以明顯抑制造模劑引起的動物結腸組織中IκBα的降解以及磷酸化`κBα含量的升高。10.q-PCR的結果顯示,NLRP3和caspase-1的mRNA水平在給予CAI之后相比造模組顯著降低,而ASC的mRNA水平在各組間無明顯差異。11.Western blot和免疫組織化學染色方法檢測的結果均顯示,小鼠結腸組織中NLRP3和caspase-1的蛋白表達水平在給予CAI之后,有顯著的下調(diào)。而ASC的表達在各組間無明顯差異。12.使用CCK-8法和SRB法檢測細胞增殖發(fā)現(xiàn),羧胺三唑?qū)τ赥HP-1細胞沒有明顯的抑制增殖的毒性作用。13.羧胺三唑?qū)τ贚PS刺激的分化的THP-1細胞中高表達的炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-18具有顯著的降低其分泌的作用。14.使用Western blot方法檢測LPS刺激的分化的THP-1細胞中p-IκBα和IκBα的蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)CAI可以抑制IκBα的磷酸化,高劑量的CAI還可以抑制IκBα的降解。15.使用Western blot方法檢測LPS刺激的分化的THP-1細胞中NLRP3相關蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)CAI可以抑制NLRP3蛋白的表達和caspase-1的活化,而ASC在各組之間無明顯差異。結論CAI能夠明顯改善實驗動物的體重、食物消耗量、臨床評分、宏觀評分和組織學評分等情況。同時明顯減輕動物結腸充血、腸壁變薄的情況,減小黏膜缺損區(qū);組織學觀察可見黏膜損害累及的結腸范圍縮小,毛細血管擴張、淋巴濾泡增生、黏膜下層水腫和隱窩結構破壞程度明顯減輕。CAI能顯著降低結腸炎小鼠結腸勻漿中MPO的活性;顯著降低結腸炎小鼠血清中Linpocalin-2的含量;對維持腸道完整性有明顯的保護作用。對結腸勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18等細胞因子水平具有明顯抑制作用,且明顯下調(diào)結腸組織中NF-κB p65核轉(zhuǎn)位水平。其可能是通過NF-κB和NLRP3炎癥體通路發(fā)揮作用。表明CAI對小鼠實驗性結腸炎具有良好的治療作用,其藥效發(fā)揮的作用機制可能與其抑制NF-κB和NLRP3炎癥體的激活,進而降低炎癥組織中升高的TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性細胞因子的水平有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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本文編號：1537761