本文關鍵詞： 未成熟卵母細胞 成熟前老化 體外成熟 染色體 線粒體 未成熟卵母細胞 成熟前老化 體外成熟 氧化應激 重金屬耦合劑 抗氧化劑　出處：《廣州醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分小鼠卵母細胞體外成熟前老化的染色體及線粒體分布變化研究背景近年來,臨床生殖醫(yī)學技術得到了飛速的發(fā)展,為無數(shù)不孕不育夫妻解決了生育小孩的問題。而由于工作壓力及生活等各種因素,許多婦女常常只能大齡生育。然而,在絕經(jīng)期來臨之前,女性生殖力明顯呈現(xiàn)出與年齡相關的下降趨勢。隨著年齡的增長,尤其是超過35歲,卵子數(shù)量和卵母細胞的質(zhì)量逐漸下降,從而導致越來越多不孕的問題。因此,卵母細胞衰老的問題受到越來多的關注。由于胚胎細胞質(zhì)幾乎直接來源于卵母細胞,因此卵母細胞的質(zhì)量直接影響胚胎的后續(xù)發(fā)育能力。在輔助生殖技術(ART)中,患者進行控制性促排卵(COH)治療時,由于臨床上促排卵方案種類繁多,需要根據(jù)患者個體化進行選擇,因此每個患者在HCG刺激排卵前所用的促排卵的方案及所用時間各有不同。然而,當不同卵母細胞在不同卵泡中刺激發(fā)育時并不完全是同步的,有些卵子在卵泡中發(fā)育得比較快,而有些卵子發(fā)育得較慢,這些不同步發(fā)育的卵子在HCG同一時間進行刺激排卵時,就會出現(xiàn)較早開始發(fā)育的卵子就有可能在HCG排出前在GV期就老化了,而有些卵子仍然處于年輕的階段。我們把這種在促性腺激素刺激排卵前卵子在GV期就發(fā)生老化的過程稱為“卵子成熟前老化”。這種情況在ART的患者中很常見,也會在高齡婦女或PCOS患者中常常發(fā)生,這也可能是這些患者卵子質(zhì)量低下胚胎發(fā)育不良的原因之一。同時,這也可能是ART中患者取出的卵子數(shù)量很多,而最后形成正常胚胎進行移植的數(shù)量很少的原因之一,因為未成熟的卵子在成熟前就發(fā)生老化,會改變卵子的受精結局,非整倍體或染色體異常經(jīng)常被認為是導致卵子不能受精或受精后形成染色體異常的胚胎,從而導致移植失敗的重要原因之一。而線粒體作為細胞中的主要產(chǎn)能場所,其分布及功能的變化也會極大的影響著細胞內(nèi)各種生理活動的正常運轉。很少有人在這些成熟前就發(fā)生老化的未成熟的卵子上面進行研究,老化的卵子的染色體情況及其線粒體分布的變化目前仍然未知。了解成熟前老化的GV卵子的染色體結構及線粒體分布的變化為有利于闡明成熟前老化卵母細胞的低發(fā)育潛能和高損失率的機制,同時為在臨床上提高老化卵子的質(zhì)量提供新的思路。研究目的在本研究中我們通過體外小鼠未成熟卵母細胞用IBMX使其在GV期分別停止發(fā)育12小時、24小時和36小時,模擬體內(nèi)卵子不同時間段成熟前老化的狀態(tài),隨后進行進一步體外成熟,檢查其染色體是否異常及成熟前老化的GV期卵子的染色體和線粒體分布情況與成熟率是否相關,為了解老化卵子低成熟率和胚胎低發(fā)育率的機制有重要的作用,同時為提高卵子質(zhì)量提供理論依據(jù)和提供新策略。研究方法1.體外培養(yǎng)體系中加入3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX),對小鼠未成熟卵子進行體外老化及體外成熟處理。拾獲的小鼠未成熟卵母細胞分為四組:1)成熟前老化0小時組(0hrs);2)成熟前老化12小時組(12hrs);3)成熟前老化24小時組(24hrs組);4)成熟前老化36小時組(36hrs組);5)體內(nèi)成熟的小鼠卵母細胞1.1實驗小鼠進行PMSG促卵母細胞發(fā)育,體內(nèi)成熟的卵子HCG促排卵。1.2 GV期未成熟卵母細胞和MII期成熟卵母細胞的收集。1.3三組卵母細胞分別體外成熟前老化12小時、24小時和36小時,0小時組直接體外成熟。1.4三組卵母細胞成熟前老化后移除IBMX,進行體外成熟培養(yǎng)。2.對新鮮體內(nèi)成熟卵母細胞和不同老化時間的小鼠卵母細胞進行成熟率和染色體、線粒體的檢查。2.1 GVBD率和MII率。計算每個組核膜破裂消失(GVBD)的卵子數(shù)量和第一極體卵子吐出(MII)成熟階段的卵子數(shù)量。2.2 MII期卵母細胞染色體檢查體內(nèi)成熟的新鮮卵子及不同時期體外老化的卵子每組隨機挑選10枚進行單細胞全基因組擴增和染色體CNV檢查。2.3線粒體活動分布。Mitotracker Red CMXRos對GV期卵母細胞進行線粒體分布檢查。研究結果1.小鼠未成熟卵子體外老化后卵子成熟率下降。2.體外成熟前老化時間延長,染色體異常數(shù)量增多。3.卵母細胞成熟前老化時間越長,線粒體異常分布增高。研究結論1、新鮮體內(nèi)/體內(nèi)成熟的卵子染色體大多數(shù)正常,體外成熟前老化的卵母細胞在體外老化時間越長,其染色體異常的卵子數(shù)量明顯增多,同時出現(xiàn)非整倍體的幾率也隨之升高。2、成熟前老化越嚴重,其線粒體活力下降,染色體異常率升高,從而影響卵母細胞進一步成熟及發(fā)育的能力,這很可能是衰老卵子其胚胎形成率及發(fā)育能力低下的重要原因。第二部分重金屬耦合劑和抗氧化劑在小鼠卵母細胞體外成熟前老化中的保護作用研究背景不孕癥近年在人群中是一個很大的健康問題。隨著女性生育年齡的增高,越來越多的夫婦需要依靠輔助生殖技術(ART)獲得懷孕,因此輔助生殖技術是不孕患者取得懷孕的希望。就目前而言,隨著女性生育年齡不斷推遲,導致卵子老化的問題日益嚴重,同時也為輔助生殖技術提出更高要求。毫無疑問,健康的卵子是成功受精,胚胎移植和后續(xù)移植后成功種植的重要保證。然而,在ART中,患者進行控制性促排卵治療時,當不同卵母細胞在不同卵泡中發(fā)育時并不全是同步的,當有些卵子在卵泡中發(fā)育得較其他卵子快時,這些卵子在HCG刺激卵子排卵時,這些較早發(fā)育的卵子就有可能在HCG排出前在GV期就老化了,我們把這種在促性腺激素刺激排卵前卵子就發(fā)生老化的過程稱為“卵子成熟前老化”。這種情況在輔助生殖技術中很常見,這也可能是這些患者卵子質(zhì)量低下胚胎發(fā)育不良的原因之一。未成熟卵子在其成熟前就發(fā)生老化會改變卵子的受精結局。在影響輔助生殖技術的各種不利因素中,氧化應激(OS)被認為是影響卵母細胞發(fā)育和成熟的重要因素之一。氧化應激來源于活性氧(ROS)與生物抗氧化劑之間的平衡被打破,造成活性氧濃度增高,而高濃度活性氧會破壞細胞內(nèi)的正常生命活動,造成細胞DNA損傷,使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂類改變,細胞器結構及功能受損,最終導致細胞死亡。人類在許多不同生殖狀態(tài)下都存在氧化應激狀態(tài),尤其是在進行輔助生殖技術(ART)過程中,體外操作不能完全模擬真實的體內(nèi)生理條件,多種因素都可能導致氧化應激的產(chǎn)生和增加,當其作用于精子、卵子及胚胎等,影響胚胎著床,從而影響ART治療的結局。同時,有研究發(fā)現(xiàn)重金屬也可以使卵子內(nèi)氧化應激水平升高從而影響卵子發(fā)育能力。目前來說,很多研究都發(fā)現(xiàn)重金屬耦合劑或抗氧化劑在卵子和胚胎發(fā)育有利于卵母細胞/胚胎的發(fā)育,基本都是從單一種類的重金屬耦合劑或抗氧化劑來說明問題,但很少研究會涉及單一藥物或/和混合藥物添加對成熟前老化卵子的影響。而且,目前,幾乎所有研究都關注卵母細胞減數(shù)分裂后的狀態(tài),很少報道其對卵母細胞成熟前老化的影響,也沒有研究重金屬耦合劑和抗氧化劑對GV期成熟前老化的卵母細胞的發(fā)育潛能和質(zhì)量是否有影響。在人類輔助生殖技術中GV卵子成熟前老化發(fā)生在卵子沒有及時在適當時間刺激成熟,卵子質(zhì)量就會下降,在重金屬耦合劑和抗氧化劑對成熟前老化的卵母細胞的保護作用目前仍然未知。因此,在本研究中,小鼠卵子用IBMX模擬人類輔助生殖技術控制性促排卵中卵子成熟前老化,并用不同藥物培養(yǎng)不同的時間段,然后卵子進行IVM評估重金屬耦合劑和抗氧化劑在小鼠卵子細胞器中的作用。我們的研究中,GV期的小鼠卵子在含有IBMX的培養(yǎng)液中培養(yǎng)可以避免發(fā)生減數(shù)分裂,從而讓卵子維持在GV期,而添加重金屬耦合劑(EDTA),抗氧化劑(檸檬酸鈉、硫辛酸(ALA)和乙酰肉堿(ALCAR)),分別體外成熟前老化12小時、24小時和36小時,然后再把卵子體外成熟培養(yǎng)(IVM)。IVM后,卵子通過生發(fā)泡破裂(GVBD)、減數(shù)分裂、線粒體活動分布、紡錘體組裝和DNA碎片(DSBs)等指標檢測來評估體外成熟前老化卵子的細胞質(zhì)量,為探索人類ART周期中成熟前老化卵母細胞的低發(fā)育潛能和高損失率的機制提供新的思路,同時為治療ART中由于卵子老化引起的胚胎發(fā)育不良等后果提供理論依據(jù)。研究目的因此,在本研究中,小鼠未成熟卵母細胞用IBMX使其在GV期分別停止發(fā)育12小時、24小時和36小時,模擬體內(nèi)卵子成熟前老化狀態(tài),體外培養(yǎng)過程中通過培養(yǎng)液中添加重金屬耦合劑EDTA和抗氧化劑檸檬酸鈉、硫辛酸ALA和乙酰肉堿ALCAR,然后對體外老化的卵母細胞進行體外成熟培養(yǎng),老化后的成熟卵母細胞通過GVBD率、MII率、線粒體活動分布、紡錘體組裝等指標檢測來評估體外成熟前老化卵子的細胞質(zhì)量,未能成熟的GV期卵母細胞進行DNA碎片(DSBs)檢查,從而評估重金屬耦合劑和抗氧化劑對體外老化的小鼠卵母細胞是否有保護卵子免受氧化應激損傷,提高卵子受精發(fā)育能力的作用,在防止卵子老化和為高齡婦女等患者提供輔助生殖策略等方面均有重要的意義。研究方法1.體外培養(yǎng)體系中加入重金屬耦合劑和抗氧化劑,對小鼠未成熟卵子進行體外老化及體外成熟處理。拾獲的小鼠未成熟卵母細胞分為五組:1)重金屬耦合劑組(MC);2)抗氧化劑組(AO組);3)重金屬耦合劑和抗氧化劑組(MC+AO組);4)對照組(Control組)。5)新鮮組1.1實驗小鼠進行PMSG促排卵。1.2 GV期未成熟卵母細胞的收集。1.3新鮮組卵母細胞直接體外成熟培養(yǎng)。1.4實驗組和對照組卵母細胞分別體外成熟前老化12小時、24小時和36小時。1.5實驗組和對照組卵母細胞成熟前老化后移除IBMX,進行體外成熟培養(yǎng)。2.對新鮮組卵母細胞和不同老化時間的小鼠卵母細胞進行成熟率和其他能量代謝指標檢查。2.1 GVBD率和MII率。計算每個組核膜破裂消失(GVBD)的卵子數(shù)量和第一極體卵子吐出(MII)成熟階段的卵子數(shù)量。2.2線粒體活動分布。Mitotracker Red CMXRos線粒體分布檢查2.3紡錘體形態(tài)及染色體排列。采用免疫熒光細胞化學法進行紡錘體和染色體檢查。2.4卵母細胞DNA損傷DSBs。GV期停滯卵母細胞用DNA損傷探針γ-H2AX抗體進行DSBs檢查。研究結果1.重金屬耦合劑和抗氧化劑提高老化卵子成熟率小鼠未成熟卵子經(jīng)過體外成熟前老化12小時、24小時和36小時后再進行IVM,14-16小時后計算其GVBD率和MII成熟率。當卵子經(jīng)過成熟前老化12小時后,GVBD率和MII成熟率在四個組中沒有統(tǒng)計學差異。當成熟前老化延長至24小時和36小時,卵子在重金屬耦合劑和抗氧化劑處理組和對照組在GVBD率中仍然沒有差異。隨著體外老化培養(yǎng)的時間延長,所有組中的卵母細胞的成熟率都有明顯下降,然而,在24小時和36小時中在重金屬耦合劑和/或抗氧化劑組中卵母細胞達到MII期的比率明顯比對照組高(P0.05)。2.重金屬耦合劑和抗氧化劑在線粒體分布中的作用和延遲線粒體凋亡。線粒體分布及其功能對卵子成熟和進一步發(fā)育有著重要影響。異常線粒體活性成簇狀/團裝分布,我們的結果顯示,30.6%-47.5%的卵母細胞在12小時成熟前老化后呈現(xiàn)異常線粒體分布模式,而各組之間沒有統(tǒng)計學差異。當卵母細胞經(jīng)過24小時-36小時成熟前老化后,我們再檢測其線粒體分布情況,重金屬耦合劑和/或抗氧化劑組中卵母細胞的異常線粒體分布明顯低于對照組。當成熟前老化時間從12小時延長到36小時,卵母細胞異常線粒體分布在所有組中都有升高(P0.05)。3.EDTA、檸檬酸鈉、ALA和ALCAR維持老化卵子的正常紡錘體形態(tài)和染色體排列卵子質(zhì)量同樣取決于正常紡錘體形態(tài)和染色體排列。異常紡錘體/和染色體排列的比例在對照組明顯高于重金屬耦合劑和/或抗氧化劑處理組,重金屬耦合劑組卵母細胞的異常紡錘體/和染色體排列比率在12-36小時成熟前老化中都比對照組低(P0.05),抗氧化劑組和混合組在12小時和24小時成熟前老化中跟對照組沒有出現(xiàn)差異,只有在36小時成熟前老化中才出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P0.05)。4.重金屬耦合劑和抗氧化劑可以降低DNA損傷形成ROS和抗氧化劑的不平衡可以導致不同形式的DNA損傷,DSBs是最嚴重的DNA損傷表現(xiàn)之一,嚴重威脅卵子的活力甚至生命。我們發(fā)現(xiàn),12小時成熟前老化中,DSBs平均熒光強度在抗氧化劑組明顯低于其他組,但其他組沒有差異,當成熟前老化延長至24小時,抗氧化劑組和混合組仍然維持低水平。24-36小時成熟前老化后混合組同樣顯示低水平。結果提示重金屬耦合劑和抗氧化劑對于ROS形成的DNA損傷在長時間體外培養(yǎng)有保護作用,但抗氧化劑硫辛酸和乙酰肉堿比重金屬耦合劑的保護作用更強大�？偟膩碚f,我們發(fā)現(xiàn),重金屬耦合劑和抗氧化劑在提高成熟率、保護線粒體功能、紡錘體形態(tài)和DNA組裝方面可以有明顯抗氧化作用,從而保護卵子免受OS損傷。當體外老化時間延長到12-36小時,重金屬耦合劑和抗氧化劑的保護作用愈加明顯。線粒體功能損傷、異常紡錘體和DNA損傷可能與老化卵子的低發(fā)育率有關系。因此,沃恩的研究建議,重金屬耦合劑和抗氧化劑可以添加到培養(yǎng)液中以保護卵子免受氧化應激損傷。研究結論1、體外成熟前老化的卵母細胞在體外培養(yǎng)過程中其線粒體功能損傷、異常紡錘體發(fā)生和DNA損傷可能與老化卵子的低發(fā)育率有關系。2、隨著體外成熟前老化培養(yǎng)時間延長,卵母細胞在成熟率、正常線粒體和紡錘體分布排列、DSBs方面明顯下降。3、在體外培養(yǎng)中添加重金屬耦合劑EDTA和抗氧化劑檸檬酸鈉、硫辛酸和乙酰肉堿后能延緩卵子老化的時間,保護卵子免受氧化應激損傷。4、抗氧化劑對體外成熟前老化的卵母細胞因氧化應激造成DNA損傷有較明顯的保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714.8

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本文編號：1531100