本文關鍵詞： 小鼠胚胎干細胞 肝樣組織 馬兜鈴酸-1 積雪草酸 五味子乙素 肝細胞癌 炎癥 癌前病變 白細胞介素-6旁分泌 白蛋白 肝細胞核因子4α α1-抗胰蛋白酶 細胞色素P450酶系 血小板內皮細胞粘附分子-1 原癌蛋c-Myc 甲胎蛋白 谷　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分:馬兜鈴酸-Ⅰ致胚胎干細胞衍生擬胚體分化肝樣組織過程癌前病變評價模型建立目的:利用人類致癌劑馬兜鈴酸-Ⅰ(aristolochic acid I,AAI)與小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)細胞衍生擬胚體(embryoid body,EB)分化肝樣組織過程共孵育體系,構建肝臟癌前病變體外替代研究模型,評價化合物是否具有潛在致肝癌前病變作用。方法:ES細胞經懸滴培養(yǎng)5天得EBs,EBs貼壁培養(yǎng)18天得成熟肝樣組織;肝樣組織分化成熟時(D5+18),免疫熒光考察肝樣細胞及組織特異性蛋白表達;HE染色考察肝樣組織結構表型;qRT-PCR考察肝樣細胞功能相關基因表達水平;ELISA法考察細胞培養(yǎng)上清液中白蛋白(albumin,ALB)分泌水平;糖原合成染色、吲哚氰綠(IndocyanineGreen,ICG)攝取、尿素合成實驗考察肝樣細胞功能。MTT法得AAI與EBs共孵育濃度;EBs貼壁培養(yǎng)當天(D 5+0)開始加入AAI;D 5+18時流式細胞術檢測肝樣細胞的分化率;ELISA法檢測上清液中ALB、谷氨酸-丙酮酸轉氨酶(alaninetransaminase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、白細胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)的含量;免疫熒光檢測ALB與IL-6、信號轉導與轉錄激活子-3(signaling transducer and activator of transcription-3,STAT3)、磷酸化 STAT3(p-STAT3)、原癌蛋白 Myc(oncogenic transcription factor Myc,c-Myc)和癌胚RNA 結合蛋白 Lin28 同源物 B(oncofetal RNA-binding protein Lin28 homolog B,Lin28B)、AFP等共表達情況;Western Blot檢測肝樣組織中c-Myc、Lin28B、AFP及IL-6/STAT3、核轉錄因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)、絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)等信號通路蛋白表達情況;將成熟肝樣組織注射到裸鼠背部皮下,考察肝樣組織成瘤性;將腫瘤取出制備石蠟切片,HE染色考察腫瘤的組成結構;免疫熒光考察ALB與AFP、膽管標志物細胞角蛋白7(cytokeratin7,K7)、細胞角蛋白 19(cytokeratin 19,K19)的共定位情況;Western Blot、qRT-PCR 法考察腫瘤組織惡性相關蛋白、基因的表達情況。結果:1.ES細胞衍生肝樣組織鑒定:(1)形態(tài)學表征:D5+18時,光鏡下肝樣細胞呈成熟的雙核表型;免疫熒光染色肝細胞特異性蛋白ALB、肝細胞核因子4α、α1-抗胰蛋白酶等呈陽性,ALB與肝血竇內皮細胞標志蛋白血小板內皮細胞粘附分子PECAM-1鑲嵌成肝樣組織表型;HE染色可見典型的肝樣組織血竇樣結構與肝樣細胞鑲嵌排列;(2)功能表征:qRT-PCR結果顯示肝樣細胞細胞色素P450代謝酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶等基因表達水平接近肝臟細胞實際水平;肝樣細胞顯示出穩(wěn)定的ALB分泌水平、尿素合成水平、糖原合成水平及ICG攝取功能。2.AAI致ES細胞衍生EBs分化肝樣組織過程癌前病變體外替代研究評價模型構建:(1)分化體系質控指標:終點流式細胞術、免疫熒光及ELISA結果顯示,與DMSO相比,1.25μM及2.50μMAAI不影響肝樣細胞的分化率、ALB分泌水平及肝血竇樣結構;(2)ELISA結果顯示,與DMSO相比,AAI顯著上調肝樣組織培養(yǎng)上清液中ALT、AST、IL-6及AFP的分泌量,提示肝樣細胞膜受到損傷,肝樣組織中Kupffer樣細胞被激活,分泌大量IL-6,使肝樣組織彌漫浸潤在炎癥微環(huán)境中;AAI顯著上調肝樣組織c-Myc及Lin28B的表達;加入AAI后,在終末分化的肝樣組織中尚有表達幼稚的肝細胞合成分泌的AFP,極少量肝樣細胞胞漿表達干性標志物八聚體結合轉錄因子-4(Oct4),提示AAI可能使肝樣組織中部分肝樣細胞發(fā)生了脫分化;(3)Western Blot結果顯示,AAI可激活IL-6/STAT3通路、顯著上調MAPK家族成員細胞外信號調節(jié)激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化水平及激活蛋白-1(activatorprotein 1,AP-1)成員c-Jun和c-Fos的入核水平;(4)體內評價階段,DMSO與AAI組肝樣組織細胞注射到裸鼠皮下均能成瘤;HE染色結果顯示,DMSO組腫瘤內細胞類型雜亂無章,呈畸胎瘤三胚層結構;AAI組腫瘤內部大多結構較單一,偶見畸胎瘤結構,部分腫瘤內存在細胞呈核大深染的HCC樣特征區(qū)域;免疫熒光結果顯示,DMSO組腫瘤未見ALB分別與AFP、K7、K19共染的細胞;AAI組腫瘤ALB與AFP、K7、K19的共染率分別為37.50%,54.17%和50.00%,提示AAI組腫瘤內的肝樣細胞較幼稚,呈腫瘤祖/干細胞表型,這些細胞很可能是形成該組腫瘤的源細胞。結論:利用AAI引起ES細胞衍生EBs分化肝樣組織炎性損傷伴癌前病變表型特征,初步構建了 ES細胞衍生EBs分化成熟肝樣組織癌前病變體外預測評價體系,為研究肝臟癌前病變、預測評價化合物的潛在致肝臟癌前病變作用提供體外替代模型。第二部分:馬兜鈴酸-Ⅰ致分化成熟肝樣組織癌前病變評價模型建立目的:利用AAI與ES細胞衍生成熟的肝樣組織共孵育體系,構建肝臟癌前病變體外替代模型,評價化合物是否具有潛在致肝癌前病變作用。方法:ES細胞經懸滴培養(yǎng)5天EBs,EBs貼壁培養(yǎng)18天得成熟肝樣組織;MTT法得AAI與成熟肝樣組織共孵育濃度;肝樣組織分化成熟時(D 5+18)開始持續(xù)加入AAI 10天(D 23+0至D 23+10);D 23+10時,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中ALB、IL-6含量;免疫熒光檢測ALB與p-STAT3、c-Myc、Lin28B、AFP、NF-κB(p65)及 NF-κB(p50)共定位情況。結果:1.25,2.50,5.00,10.00 μMAAI與成熟肝樣組織共孵育10天,ELISA和免疫熒光結果顯示,與對照組相比,1.25,2.50 μM AAI不影響肝樣細胞表達并分泌ALB水平,5.00,10.00 μM AAI分別從加入第8天和第6天起顯著下調ALB分泌水平;其中與10.00 μM AAI共孵育還伴有少量肝樣細胞凋亡發(fā)生;1.25,2.50,5.00,10.00 μM AAI均能顯著上調IL-6分泌水平;與10.00 μMAAI共孵育時,IL-6分泌呈先升后降的趨勢;綜合考慮選擇5.00 μM AAI進行后續(xù)實驗;免疫熒光結果顯示,與5.00μM AAI共孵育10天,肝樣組織中出現(xiàn)少量c-Myc,Lin28B,AFP與ALB共表達的肝樣細胞,同時NF-κB(p65)也有少量入核激活,提示AAI與分化成熟的肝樣組織共孵育也可引發(fā)癌前病變。結論:初步構建了分化成熟的肝樣組織與AAI共孵育癌前病變體外預測評價體系,為研究肝臟癌前病變、預測評價化合物的潛在致肝臟癌前病變作用提供體外替代模型。附:積雪草酸、五味子乙素對馬兜鈴酸-Ⅰ致胚胎干細胞衍生EBs分化肝樣組織炎癥及癌前病變對抗活性相關研究目的:探索積雪草酸(Asiatic acid,AA)和五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是否具有對抗AAI致ES細胞衍生EBs分化肝樣組織炎癥損傷和癌前病變的活性,論證該體外替代模型的適用性。方法:MTT法得AA和Sch B分別與AAI共孵育ES細胞及EBs分化肝樣組織過程共孵育的濃度;EBs貼壁培養(yǎng)當天開始加入2.5 μM AAI和適合濃度的AA或SchB,肝樣組織分化成熟時,流式細胞術檢測肝樣細胞分化率;ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中ALB、ALT、IL-6和AFP含量;免疫熒光檢測ALB與IL-6、c-Myc和Lin28B等蛋白共定位情況;Western Blot法檢測肝樣組織中炎癥、癌前病變相關蛋白的表達;分別將與DMSO、AAI、AAI+AA共孵育的肝樣組織注射到裸鼠皮下,考察AA對AAI致衍生肝樣組織成瘤性的影響;將腫瘤取出制備石蠟切片,HE染色考察各組腫瘤的組成結構,免疫熒光雙染法考察癌前病變相關蛋白的表達情況。結果:(1)ELISA結果顯示,單加AAI組上清液ALT、IL-6和AFP較DMSO組均顯著上調;1.00 μM AA及5.0、10.0 μM Sch B與AAI共孵育,上清液ALT和IL-6含量顯著下調;僅1.00 μMAA與AAI共孵育,AFP的含量與單加AAI組相比顯著下調,而SchB不能下調上清液中AFP的含量。(2)Western Blot及免疫熒光結果顯示,1.00 μM AA顯著下調AAI致c-Myc、Lin28B、AFP的表達上調,Sch B不能下調AAI引起的c-Myc、Lin28B和AFP的表達上調;AA、Sch B可顯著下調AAI致衍生肝樣組織IL-6/STAT3、p-ERK1/2 MAPK及c-Fos AP-1的表達上調,且10.0 μM SchB可顯著上調Nrf2的表達。(3)體內評價階段HE染色顯示,AAI+AA組呈細胞核大深染、有絲分裂相多、排列紊亂、假小葉或微血管浸潤等HCC樣表型的腫瘤數(shù)量(10/23)與AAI組(11/23)沒有顯著性差異;免疫熒光結果顯示,與DMSO組相比,AAI組腫瘤ALB與AFP、K7、K19共染的細胞顯著增多,共染率分別為43.48%,69.57%和65.22%;AAI+AA組ALB+AFP共染率顯著下調至17.39%,而ALB與K7、K19的共染率與AAI組相比沒有顯著改變。結論:AA對AAI致ES細胞衍生EBs分化肝樣組織過程炎性損傷及癌前病變表型,具有一定體外對抗活性;SchB對AAI致ES細胞衍生EBs分化肝樣組織過程炎性損傷,具有一定體外保護活性,但對癌前病變相關表征未呈現(xiàn)干預活性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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