本文關(guān)鍵詞： 小鼠胚胎干細(xì)胞 肝樣組織 馬兜鈴酸-1 積雪草酸 五味子乙素 肝細(xì)胞癌 炎癥 癌前病變 白細(xì)胞介素-6旁分泌 白蛋白 肝細(xì)胞核因子4α α1-抗胰蛋白酶 細(xì)胞色素P450酶系 血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1 原癌蛋c-Myc 甲胎蛋白 谷　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分:馬兜鈴酸-Ⅰ致胚胎干細(xì)胞衍生擬胚體分化肝樣組織過程癌前病變?cè)u(píng)價(jià)模型建立目的:利用人類致癌劑馬兜鈴酸-Ⅰ(aristolochic acid I,AAI)與小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)細(xì)胞衍生擬胚體(embryoid body,EB)分化肝樣組織過程共孵育體系,構(gòu)建肝臟癌前病變體外替代研究模型,評(píng)價(jià)化合物是否具有潛在致肝癌前病變作用。方法:ES細(xì)胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)5天得EBs,EBs貼壁培養(yǎng)18天得成熟肝樣組織;肝樣組織分化成熟時(shí)(D5+18),免疫熒光考察肝樣細(xì)胞及組織特異性蛋白表達(dá);HE染色考察肝樣組織結(jié)構(gòu)表型;qRT-PCR考察肝樣細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)水平;ELISA法考察細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白蛋白(albumin,ALB)分泌水平;糖原合成染色、吲哚氰綠(IndocyanineGreen,ICG)攝取、尿素合成實(shí)驗(yàn)考察肝樣細(xì)胞功能。MTT法得AAI與EBs共孵育濃度;EBs貼壁培養(yǎng)當(dāng)天(D 5+0)開始加入AAI;D 5+18時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝樣細(xì)胞的分化率;ELISA法檢測(cè)上清液中ALB、谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(alaninetransaminase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)的含量;免疫熒光檢測(cè)ALB與IL-6、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子-3(signaling transducer and activator of transcription-3,STAT3)、磷酸化 STAT3(p-STAT3)、原癌蛋白 Myc(oncogenic transcription factor Myc,c-Myc)和癌胚RNA 結(jié)合蛋白 Lin28 同源物 B(oncofetal RNA-binding protein Lin28 homolog B,Lin28B)、AFP等共表達(dá)情況;Western Blot檢測(cè)肝樣組織中c-Myc、Lin28B、AFP及IL-6/STAT3、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)、絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)等信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況;將成熟肝樣組織注射到裸鼠背部皮下,考察肝樣組織成瘤性;將腫瘤取出制備石蠟切片,HE染色考察腫瘤的組成結(jié)構(gòu);免疫熒光考察ALB與AFP、膽管標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白7(cytokeratin7,K7)、細(xì)胞角蛋白 19(cytokeratin 19,K19)的共定位情況;Western Blot、qRT-PCR 法考察腫瘤組織惡性相關(guān)蛋白、基因的表達(dá)情況。結(jié)果:1.ES細(xì)胞衍生肝樣組織鑒定:(1)形態(tài)學(xué)表征:D5+18時(shí),光鏡下肝樣細(xì)胞呈成熟的雙核表型;免疫熒光染色肝細(xì)胞特異性蛋白ALB、肝細(xì)胞核因子4α、α1-抗胰蛋白酶等呈陽性,ALB與肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子PECAM-1鑲嵌成肝樣組織表型;HE染色可見典型的肝樣組織血竇樣結(jié)構(gòu)與肝樣細(xì)胞鑲嵌排列;(2)功能表征:qRT-PCR結(jié)果顯示肝樣細(xì)胞細(xì)胞色素P450代謝酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等基因表達(dá)水平接近肝臟細(xì)胞實(shí)際水平;肝樣細(xì)胞顯示出穩(wěn)定的ALB分泌水平、尿素合成水平、糖原合成水平及ICG攝取功能。2.AAI致ES細(xì)胞衍生EBs分化肝樣組織過程癌前病變體外替代研究評(píng)價(jià)模型構(gòu)建:(1)分化體系質(zhì)控指標(biāo):終點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光及ELISA結(jié)果顯示,與DMSO相比,1.25μM及2.50μMAAI不影響肝樣細(xì)胞的分化率、ALB分泌水平及肝血竇樣結(jié)構(gòu);(2)ELISA結(jié)果顯示,與DMSO相比,AAI顯著上調(diào)肝樣組織培養(yǎng)上清液中ALT、AST、IL-6及AFP的分泌量,提示肝樣細(xì)胞膜受到損傷,肝樣組織中Kupffer樣細(xì)胞被激活,分泌大量IL-6,使肝樣組織彌漫浸潤(rùn)在炎癥微環(huán)境中;AAI顯著上調(diào)肝樣組織c-Myc及Lin28B的表達(dá);加入AAI后,在終末分化的肝樣組織中尚有表達(dá)幼稚的肝細(xì)胞合成分泌的AFP,極少量肝樣細(xì)胞胞漿表達(dá)干性標(biāo)志物八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4(Oct4),提示AAI可能使肝樣組織中部分肝樣細(xì)胞發(fā)生了脫分化;(3)Western Blot結(jié)果顯示,AAI可激活I(lǐng)L-6/STAT3通路、顯著上調(diào)MAPK家族成員細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化水平及激活蛋白-1(activatorprotein 1,AP-1)成員c-Jun和c-Fos的入核水平;(4)體內(nèi)評(píng)價(jià)階段,DMSO與AAI組肝樣組織細(xì)胞注射到裸鼠皮下均能成瘤;HE染色結(jié)果顯示,DMSO組腫瘤內(nèi)細(xì)胞類型雜亂無章,呈畸胎瘤三胚層結(jié)構(gòu);AAI組腫瘤內(nèi)部大多結(jié)構(gòu)較單一,偶見畸胎瘤結(jié)構(gòu),部分腫瘤內(nèi)存在細(xì)胞呈核大深染的HCC樣特征區(qū)域;免疫熒光結(jié)果顯示,DMSO組腫瘤未見ALB分別與AFP、K7、K19共染的細(xì)胞;AAI組腫瘤ALB與AFP、K7、K19的共染率分別為37.50%,54.17%和50.00%,提示AAI組腫瘤內(nèi)的肝樣細(xì)胞較幼稚,呈腫瘤祖/干細(xì)胞表型,這些細(xì)胞很可能是形成該組腫瘤的源細(xì)胞。結(jié)論:利用AAI引起ES細(xì)胞衍生EBs分化肝樣組織炎性損傷伴癌前病變表型特征,初步構(gòu)建了 ES細(xì)胞衍生EBs分化成熟肝樣組織癌前病變體外預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)體系,為研究肝臟癌前病變、預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)化合物的潛在致肝臟癌前病變作用提供體外替代模型。第二部分:馬兜鈴酸-Ⅰ致分化成熟肝樣組織癌前病變?cè)u(píng)價(jià)模型建立目的:利用AAI與ES細(xì)胞衍生成熟的肝樣組織共孵育體系,構(gòu)建肝臟癌前病變體外替代模型,評(píng)價(jià)化合物是否具有潛在致肝癌前病變作用。方法:ES細(xì)胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)5天EBs,EBs貼壁培養(yǎng)18天得成熟肝樣組織;MTT法得AAI與成熟肝樣組織共孵育濃度;肝樣組織分化成熟時(shí)(D 5+18)開始持續(xù)加入AAI 10天(D 23+0至D 23+10);D 23+10時(shí),ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALB、IL-6含量;免疫熒光檢測(cè)ALB與p-STAT3、c-Myc、Lin28B、AFP、NF-κB(p65)及 NF-κB(p50)共定位情況。結(jié)果:1.25,2.50,5.00,10.00 μMAAI與成熟肝樣組織共孵育10天,ELISA和免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,1.25,2.50 μM AAI不影響肝樣細(xì)胞表達(dá)并分泌ALB水平,5.00,10.00 μM AAI分別從加入第8天和第6天起顯著下調(diào)ALB分泌水平;其中與10.00 μM AAI共孵育還伴有少量肝樣細(xì)胞凋亡發(fā)生;1.25,2.50,5.00,10.00 μM AAI均能顯著上調(diào)IL-6分泌水平;與10.00 μMAAI共孵育時(shí),IL-6分泌呈先升后降的趨勢(shì);綜合考慮選擇5.00 μM AAI進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);免疫熒光結(jié)果顯示,與5.00μM AAI共孵育10天,肝樣組織中出現(xiàn)少量c-Myc,Lin28B,AFP與ALB共表達(dá)的肝樣細(xì)胞,同時(shí)NF-κB(p65)也有少量入核激活,提示AAI與分化成熟的肝樣組織共孵育也可引發(fā)癌前病變。結(jié)論:初步構(gòu)建了分化成熟的肝樣組織與AAI共孵育癌前病變體外預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)體系,為研究肝臟癌前病變、預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)化合物的潛在致肝臟癌前病變作用提供體外替代模型。附:積雪草酸、五味子乙素對(duì)馬兜鈴酸-Ⅰ致胚胎干細(xì)胞衍生EBs分化肝樣組織炎癥及癌前病變對(duì)抗活性相關(guān)研究目的:探索積雪草酸(Asiatic acid,AA)和五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是否具有對(duì)抗AAI致ES細(xì)胞衍生EBs分化肝樣組織炎癥損傷和癌前病變的活性,論證該體外替代模型的適用性。方法:MTT法得AA和Sch B分別與AAI共孵育ES細(xì)胞及EBs分化肝樣組織過程共孵育的濃度;EBs貼壁培養(yǎng)當(dāng)天開始加入2.5 μM AAI和適合濃度的AA或SchB,肝樣組織分化成熟時(shí),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝樣細(xì)胞分化率;ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中ALB、ALT、IL-6和AFP含量;免疫熒光檢測(cè)ALB與IL-6、c-Myc和Lin28B等蛋白共定位情況;Western Blot法檢測(cè)肝樣組織中炎癥、癌前病變相關(guān)蛋白的表達(dá);分別將與DMSO、AAI、AAI+AA共孵育的肝樣組織注射到裸鼠皮下,考察AA對(duì)AAI致衍生肝樣組織成瘤性的影響;將腫瘤取出制備石蠟切片,HE染色考察各組腫瘤的組成結(jié)構(gòu),免疫熒光雙染法考察癌前病變相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)ELISA結(jié)果顯示,單加AAI組上清液ALT、IL-6和AFP較DMSO組均顯著上調(diào);1.00 μM AA及5.0、10.0 μM Sch B與AAI共孵育,上清液ALT和IL-6含量顯著下調(diào);僅1.00 μMAA與AAI共孵育,AFP的含量與單加AAI組相比顯著下調(diào),而SchB不能下調(diào)上清液中AFP的含量。(2)Western Blot及免疫熒光結(jié)果顯示,1.00 μM AA顯著下調(diào)AAI致c-Myc、Lin28B、AFP的表達(dá)上調(diào),Sch B不能下調(diào)AAI引起的c-Myc、Lin28B和AFP的表達(dá)上調(diào);AA、Sch B可顯著下調(diào)AAI致衍生肝樣組織IL-6/STAT3、p-ERK1/2 MAPK及c-Fos AP-1的表達(dá)上調(diào),且10.0 μM SchB可顯著上調(diào)Nrf2的表達(dá)。(3)體內(nèi)評(píng)價(jià)階段HE染色顯示,AAI+AA組呈細(xì)胞核大深染、有絲分裂相多、排列紊亂、假小葉或微血管浸潤(rùn)等HCC樣表型的腫瘤數(shù)量(10/23)與AAI組(11/23)沒有顯著性差異;免疫熒光結(jié)果顯示,與DMSO組相比,AAI組腫瘤ALB與AFP、K7、K19共染的細(xì)胞顯著增多,共染率分別為43.48%,69.57%和65.22%;AAI+AA組ALB+AFP共染率顯著下調(diào)至17.39%,而ALB與K7、K19的共染率與AAI組相比沒有顯著改變。結(jié)論:AA對(duì)AAI致ES細(xì)胞衍生EBs分化肝樣組織過程炎性損傷及癌前病變表型,具有一定體外對(duì)抗活性;SchB對(duì)AAI致ES細(xì)胞衍生EBs分化肝樣組織過程炎性損傷,具有一定體外保護(hù)活性,但對(duì)癌前病變相關(guān)表征未呈現(xiàn)干預(yù)活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：1522219