本文關(guān)鍵詞： 肺動(dòng)脈高壓 ET-1 TGF-β1 PPAR-γ 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)　出處：《暨南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension,PH)是指肺血管阻力持續(xù)增高超過(guò)一定界值的病理生理狀態(tài),可導(dǎo)致右心衰竭而危及生命。目前普遍認(rèn)為PH的病理生理機(jī)制主要涉及血管收縮、細(xì)胞增殖、血管重塑、血栓形成和血管內(nèi)皮損傷,多種因素的綜合作用使肺血管壓力進(jìn)行性升高,最終導(dǎo)致右心功能衰竭和死亡,臨床治療效果不佳,發(fā)病機(jī)制不明。ET-1與肺血管重塑及肺動(dòng)脈壓力增高密切相關(guān),然而具體的分子機(jī)制仍不清楚。已有研究表明ET-1、TGF-β1及PPAR-γ均參與了PH的病理發(fā)生及發(fā)展過(guò)程,PPAR-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK及Smad信號(hào)通道激活以及ET-1高表達(dá)可能是肺動(dòng)脈高壓的病理生理基礎(chǔ),其具體機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至今尚未完全明確,值得進(jìn)一步研究。目的:通過(guò)檢測(cè)ET-1、TGF-β1在PH患者血液中的表達(dá)水平、PPAR-γ在PH患者肺組織中的表達(dá)水平、TGF-β1對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)ET-1的影響及其細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、PPAR-γ對(duì)TGF-β1刺激A549細(xì)胞表達(dá)ET-1的影響及其細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等研究,以闡明在A549細(xì)胞中TGF-β1及PPAR-γ對(duì)ET-1表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。方法:第一部分:根據(jù)患者病史、臨床癥狀及超聲心動(dòng)圖結(jié)果選取47例PH患者,采用ELISA檢測(cè)患者血清中ET-1及TGF-β1蛋白的表達(dá)水平;選取PH患者肺組織8例,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法研究PPAR-γ在PH患者肺組織的定位和表達(dá)及其臨床意義。第二部分:根據(jù)臨床研究的結(jié)果,在細(xì)胞水平上,研究TGF-β1、PPAR-γ對(duì)ET-1表達(dá)的影響,深入研究其分子調(diào)控機(jī)制。1.選擇A549細(xì)胞,用TGF-β1刺激A549細(xì)胞后,通過(guò)q RT-PCR和ELISA檢測(cè)ET-1的m RNA及蛋白表達(dá)水平,通過(guò)Western blot檢測(cè)MAPK(磷酸化p38)、JNK/SAPK和NFκB(磷酸化p65,p50亞基)等信號(hào)通道的激活情況,結(jié)合使用p38激酶抑制劑SB203580等信號(hào)通道選擇性抑制劑研究參與ET-1釋放的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。2.采用RNA干擾技術(shù)沉默PPAR-γ基因并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,另用PPAR-γ的抑制劑S2871作用于A549細(xì)胞,通過(guò)ELISA和q RT-PCR檢測(cè)沉默了PPAR-γ基因及加入抑制劑S2871后的A549細(xì)胞ET-1蛋白和m RNA表達(dá)水平有何差異;構(gòu)建含PPAR-γ基因的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,另用PPAR-γ的激動(dòng)劑S2505作用于A549細(xì)胞,通過(guò)ELISA和q RT-PCR檢測(cè)其在TGF-β1刺激作用下的ET-1分泌情況;采用Western blot檢測(cè)研究PPAR-γ在TGF-β1刺激A549細(xì)胞釋放ET-1這一過(guò)程中對(duì)其可能的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路所起的作用。結(jié)果:第一部分:PH組患者血液中ET-1和TGF-β1蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯增高,ET-1及TGF-β1蛋白的表達(dá)水平與肺動(dòng)脈收縮壓之間存在相關(guān)性,且增高的ET-1和TGF-β1之間也存在相關(guān)性;PPAR-γ在肺組織中主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞核中,PH患者肺組織的PPAR-γ表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少。第二部分:1.在體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞中,q RT-PCR和ELISA結(jié)果提示TGF-β1可誘導(dǎo)ET-1的m RNA及蛋白表達(dá)增加,同時(shí)WB檢測(cè)到phospho-p38 MAPK及phospho-Smad2表達(dá)增加,p38的特異性抑制劑SB203580可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的ET-1 m RNA及蛋白表達(dá),提示TGF-β1通過(guò)p38 MAPK及Smad2信號(hào)通路誘導(dǎo)ET-1的表達(dá)增加。2.PPAR-γ沉默或用PPAR-γ抑制劑S2871預(yù)處理A549細(xì)胞,q RT-PCR和ELISA結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)的ET-1 m RNA及蛋白表達(dá)均增加,WB同時(shí)檢測(cè)到phospho-p38 MAPK及phospho-Smad2表達(dá)增加;PPAR-γ超表達(dá)或用PPAR-γ激動(dòng)劑S2505預(yù)處理A549細(xì)胞,q RT-PCR和ELISA結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)的ET-1 m RNA及蛋白表達(dá)均下降,WB同時(shí)檢測(cè)到phospho-p38 MAPK及phospho-Smad2表達(dá)降低,提示PPAR-γ可通過(guò)p38 MAPK及Smad2調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的ET-1表達(dá)。結(jié)論:PH患者血液中的ET-1、TGF-β1表達(dá)增加,隨著PH嚴(yán)重程度的加重,ET-1及TGF-β1蛋白的表達(dá)水平越高,且增高的ET-1和TGF-β1之間存在相關(guān)性;PH患者肺組織中的PPAR-γ表達(dá)減少;在體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞中,TGF-β1通過(guò)p38 MAPK及Smad2信號(hào)通路誘導(dǎo)ET-1分泌增加且這一過(guò)程受PPAR-γ調(diào)控。
[Abstract]:Background: pulmonary arterial hypertension (Pulmonary, hypertension, PH) refers to the pulmonary vascular resistance increased more than a certain critical value of pathological and physiological conditions, can lead to right heart failure and life-threatening. It is generally believed that the pathophysiological mechanism of PH vasoconstriction, cell proliferation, vascular remodeling, thrombosis and vascular endothelial injury, comprehensive a variety of factors make the pulmonary vascular pressure increased, eventually leading to right heart failure and death, clinical treatment effect, unknown pathogenesis.ET-1 and pulmonary vascular remodeling and pulmonary artery pressure closely related, but the detailed mechanism is still unclear. Studies have shown that ET-1, TGF- and PPAR- were gamma beta 1 involved in the pathology of PH occurrence and development process of PPAR- signal transduction, MAPK and Smad signal pathway activation and high expression of ET-1 may be the pathophysiological basis of pulmonary hypertension and its mechanism And the signal transduction pathway is still not completely clear, it is worthy of further study. Objective: to detect ET-1, TGF- beta 1 in blood of patients with PH expression levels, the expression level of PPAR- gamma in lung tissue in patients with PH, ET-1 and its effect mechanism of signal transduction of TGF- beta 1 expression in A549 cells, the expression of ET-1 effect and the signal transduction mechanism of PPAR- gamma beta 1 TGF- stimulation of A549 cells, A549 cells in order to elucidate the TGF- beta 1 and PPAR- gamma on the expression of ET-1 molecular mechanism. Methods: the first part: according to the patient history, clinical symptoms and echocardiographic findings from 47 cases of PH patients, the expression level of serum in patients with ELISA detection of ET-1 and TGF- protein beta 1; a total of 8 cases of lung tissue in patients with PH by immunohistochemical staining method of PPAR- gamma in lung tissue of patients with PH localization and expression and its clinical significance. The second part: according to the clinical research The results, at the cellular level, TGF- beta 1, PPAR- gamma on the expression of ET-1, in-depth study of the molecular mechanism of.1. A549 cells with TGF- beta 1 after A549 cells were stimulated by m, the expression level of RNA protein and Q RT-PCR and ELISA ET-1 detection, blot detection of MAPK by Western (phosphorylated p38), JNK/SAPK and NF K B (phosphorylated p65, subunit P50) activation of signal channel, signal transduction binding studies using inhibitors of p38 kinase SB203580 signal channel selective inhibitors involved in ET-1 release pathway of.2. by RNA interference silencing PPAR- gene and transfected into A549 cells, another inhibitor S2871 PPAR- gamma in A549 cells, ELISA and Q by RT-PCR detection of silent PPAR- gene and A549 were added ET-1 protein and m RNA inhibitor S2871 expression level difference; construct containing PPAR- gamma gene plasmid and transfected into A549 cells, the other With a PPAR- gamma agonist S2505 in A549 cells by ELISA and Q RT-PCR detected in the TGF- beta 1 stimulation of ET-1 secretion by Western blot; detection of PPAR- gamma release ET-1 this process in the possible cellular signaling pathways play a role in beta 1 TGF- stimulation of A549 cells. Results: the first part: the expression of PH ET-1 and TGF- beta 1 protein levels in the blood of patients were significantly higher than those in control group, the expression level of ET-1 and TGF- beta 1 protein and pulmonary artery systolic pressure and the correlation between increased ET-1 and TGF- beta correlation also existed between 1; PPAR- gamma in lung tissue expression in alveolar epithelial cells and vascular endothelial cells in the nucleus, the expression of PPAR- gamma lung tissues of PH patients compared with normal control group decreased significantly. The second part: 1. in vitro cultured A549 cells, Q RT-PCR and ELISA results suggest that TGF- beta 1 can induce ET-1 M RNA and protein expression increased, while WB detected phospho-p38 MAPK and increase the expression of phospho-Smad2, a specific inhibitor of SB203580 p38 can inhibit the expression of TGF- 1 induced ET-1 m RNA and protein expression of TGF- beta 1 by p38 MAPK and Smad2 signal pathway induced by ET-1 increased.2.PPAR- or PPAR- silencing gamma gamma inhibitor S2871 pre treatment of A549 cells, Q RT-PCR and ELISA showed that the expression of TGF- beta 1 induced ET-1 m and protein of RNA were increased, WB and phospho-p38 detected MAPK and phospho-Smad2 expression increased; PPAR- overexpression or PPAR- gamma agonist S2505 pretreatment of A549 cells with Q, RT-PCR and ELISA showed that the expression of TGF- beta 1 induced by ET-1 m RNA and protein were decreased, WB and phospho-p38 detected MAPK and phospho-Smad2 expression decreased, suggesting that PPAR- through p38 MAPK and Smad2 gamma beta 1 regulates TGF- induced ET-1 expression. Conclusion: in the blood of patients with PH ET-1, TGF- beta 1 expression increased with increasing severity of PH, the expression level of ET-1 and TGF- beta 1 protein is higher, and the increase of ET-1 and TGF- beta correlation exists between 1; PPAR- gamma PH in lung tissue in patients with decreased expression; A549 cells cultured in vitro, TGF- beta 1 by p38 MAPK and Smad2 signaling pathway induced by increased secretion of ET-1 and this process by PPAR- gamma regulation.

【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R544.1

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本文編號(hào)：1521737