發(fā)布時間：2018-02-15 20:12

  本文關鍵詞： 缺氧 水代謝平衡紊亂 TRPV4 Adropin Minocycline 血腦屏障　出處：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景和目的高原是我軍重要戰(zhàn)略方向。但是,高原環(huán)境特殊,嚴重影響部隊的戰(zhàn)斗力。如何從軍事斗爭的需要出發(fā),做好急進高原部隊的衛(wèi)生保障,是我軍高原醫(yī)學研究的重要內容。平原人進入高原后,會出現(xiàn)急性高原病,包括高原肺水腫(High altitude pulmonary edema,HAPE)、高原腦水腫(High altitude cerebral edema,HACE)和急性高原反應(Acute mountain sickness,AMS)。HAPE和HACE是機體水代謝紊亂的結果;對于AMS,有人認為是輕度的高原腦水腫所致。不論是急性高原病患者還是進入高原后的相對健康人,普遍存在著飲水減少、體重降低等現(xiàn)象。因此,急進高原可引起機體以脫水或水腫為表現(xiàn)形式的水代謝紊亂。動物實驗表明,急性低壓缺氧可顯著降低大鼠的飲水量。早在1981年就有人觀察了大鼠在模擬海拔5400m急性缺氧時飲水量的變化,發(fā)現(xiàn)在缺氧的第1天,大鼠飲水量只有平原正常值的30%。尿量雖也顯著減少,但減少的程度比飲水量的減少要輕,兩者相比,尿量相對增加,機體脫水、體重降低,血球壓積(Hematocrit,Hct)增加。進一步的研究證明,急性缺氧降低大鼠飲水量不能用滲透壓感受器或容量感受器來解釋。而我們在預實驗中注意到,大鼠一旦進入缺氧環(huán)境,飲水行為立即減少,而脫離缺氧環(huán)境后飲水行為迅速恢復。我們推測,急性缺氧降低大鼠飲水量可能與中樞神經(jīng)因素有關;飲水量下降的本質可能是缺氧對渴覺神經(jīng)元的抑制或渴覺抑制性神經(jīng)元的興奮所致。參與大腦渴覺調節(jié)的神經(jīng)核團很多。研究表明,前扣帶回皮層(Anterior cingulate cortex,ACC)是渴覺調節(jié)的高級中樞,而室周器官(Circumventricular organs,CVOs)是渴覺信號的感知者和啟動者。穹窿下器(Subfornical organ,SFO)位于CVOs的中央,周圍富集大量血管及脈絡膜,且缺乏血腦屏障,易受氧分壓的影響。因此我們推測,SFO區(qū)的神經(jīng)元有可能直接感知氧分壓變化,進而影響動物的飲水行為。研究發(fā)現(xiàn),SFO神經(jīng)元上的辣椒素受體(transient receptor potential-vanilloids,TRPVs)是渴覺興奮產(chǎn)生的關鍵分子,主要包括TRPV1和TRPV4。有人通過中樞注射TRPV4激動劑,發(fā)現(xiàn)大鼠飲水量顯著降低。也有實驗證明,TRPV4對低氧分壓十分敏感,是動物缺氧性肺血管收縮的重要因素。我們推測,缺氧有可能直接激活SFO區(qū)神經(jīng)元上的TRPV4,導致大鼠飲水量減少。人和動物對高原缺氧環(huán)境的習服是在神經(jīng)體液的整體調控下完成的。除了神經(jīng)機制外,體液機制在缺氧大鼠飲水減少中可能也發(fā)揮著重要作用。文獻表明,Adropin是由Enho基因編碼的分泌型小分子蛋白,能夠調節(jié)機體的物質代謝,且中樞注射Adropin能顯著減少大鼠的飲水量。我們在預實驗中也觀察到缺氧大鼠血清中Adropin含量增高,因此,Adropin有可能是缺氧大鼠飲水量減少的體液機制之一。中度缺氧時,機體以習服代償為主,但嚴重缺氧會引起血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)的損傷和通透性增高。BBB由血管內皮細胞及其緊密連接、基膜及周圍的星型膠質細胞足突、周細胞等結構組成,是極其穩(wěn)定的中樞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持屏障。嚴重缺氧損傷BBB的原因包括內皮細胞凋亡和緊密連接蛋白降解,但相關分子機制仍未完全闡明。因此,探索BBB損傷的原因及分子機制,將有助于尋找HACE和AMS預防和治療方法。綜上所述,本課題擬在前期工作的基礎上,從缺氧飲水減少和BBB損傷兩個方向,研究急性缺氧大鼠水代謝紊亂的發(fā)生機制,這不僅有助于提高我們對高原習服機制的認識,也為我們做好急進高原部隊的衛(wèi)勤保障奠定堅實的理論基礎。材料與方法1.本研究采用動物低壓艙建立大鼠缺氧模型。分別在模擬3700m、4000m、6000m缺氧條件下研究大鼠飲水減少的發(fā)生及分子機制,在模擬8000m缺氧條件下研究血腦屏障損傷及修復方法。采用低氧細胞培養(yǎng)箱和三氣缺氧小室,在體外構建細胞缺氧模型。2.采用大鼠顱內置管技術,缺氧前10min,腦室注射TRPV1抑制劑SB-705498,TRPV4抑制劑Gadolinium和HC-067047,缺氧相應時間后精確測量動物飲水量、顱內溫度變化、滲透壓變化。體外培養(yǎng)SFO區(qū)原代神經(jīng)元和HEK293細胞,分別通過質粒和si RNA干預建立TRPV4過表達和敲降模型,利用Westernblot、Co-IP、IF、ELISA及Fura-3鈣成像技術檢測TRPV4蛋白表達及鈣通道開放情況。3.采用大鼠顱內置管技術,在大鼠缺氧前7d,特異性的AVV-sh RNA靶向敲降CVOs區(qū)TRPV4表達,通過中樞注射重組Adropin蛋白、TRPV4抑制劑HC-067047,Cam KK抑制劑STO-609,外周注射高濃度Adropin抗體等方法,缺氧相應時間后測量動物飲水量、IF檢測神經(jīng)元活性、Westernblot檢測TRPV4-Cam KK-AMPK信號通路變化;4.采用大鼠顱內置管技術,大鼠缺氧前48h,通過si RNA靶向敲降SIRT-3,缺氧前1h腹腔注射不同濃度的Minocycline,采用膠體金-電鏡和伊文思藍示蹤法檢測血腦屏障功能;在HBMECs細胞中,利用Westernblot、q RT-PCR、IF、螢光素酶報告基因法,檢測HIF-1α/SIRT-3/PHD-2信號通路和緊密連接蛋白表達變化。結果1.與常氧組相比,大鼠4000m缺氧6h不會引起血液滲透壓改變及顱內溫度變化,但是飲水量下降75%;與缺氧組相比,第三腦室注射TRPV4抑制劑Gadolinium和HC-067047,能夠顯著增加飲水量,而TRPV1抑制劑SB-705498不會引起飲水量增加;此外,與野生型相比,常氧條件下TRPV4-/-小鼠飲水量沒有明顯變化,但是在缺氧條件下,TRPV4-/-小鼠飲水量顯著增加。無論是過表達TRPV4的HEK293細胞,還是原代培養(yǎng)的SFO區(qū)神經(jīng)元,缺氧或TRPV4激動劑4α-PDD都會使胞內鈣離子迅速增加,產(chǎn)生鈣離子脈沖,但是,在普通HEK293細胞或敲降TRPV4的SFO神經(jīng)元中,缺氧幾乎不能產(chǎn)生鈣離子脈沖;在表達TRPV4的HEK293細胞和原代培養(yǎng)的SFO區(qū)神經(jīng)元中敲降血紅素氧合酶-2(heme oxygenase-2,HO-2)后,缺氧產(chǎn)生鈣離子脈沖明顯減弱,但此時TRPV4激動劑4α-PDD和抑制劑Gadolinium仍然能調控胞內鈣離子變化;TRPV4和HO-2在SFO神經(jīng)元中以二聚體的形式存在。2.與常氧組相比,大鼠3700m缺氧血清和CVOs區(qū)腦組織Adropin蛋白增加,同時CVOs區(qū)c-Fos陽性細胞數(shù)減少;與單純缺氧組相比,注射Adropin中和抗體后飲水量升高35%,c-Fos陽性細胞數(shù)增加60%。常氧情況下,大鼠中樞注射重組Adropin蛋白后飲水量和CVOs區(qū)c-Fos陽性細胞數(shù)均顯著減少;而與對照組相比,TRPV4敲降組注射重組Adropin蛋白后飲水量和c-Fos陽性細胞數(shù)顯著增加。與對照組相比,中樞注射重組Adropin蛋白后CVOs區(qū)p-Cam KK、p-AMPKα蛋白顯著增加,c-Fos陽性細胞數(shù)減少,大鼠飲水量下降;而注射TRPV4抑制劑HC-067047或Cam KK抑制劑STO-609均能降低CVOs區(qū)p-Cam KK、p-AMPKα蛋白的表達,增加c-Fos陽性細胞數(shù),部分恢復大鼠飲水量。3.與常氧組相比,8000m缺氧伊文思藍和膠體金血腦屏障通透性顯著增高,HBMECs細胞跨細胞電阻TEER減小,HIF-1α、MMP9、MMP2和VEGF蛋白及m RNA表達顯著增加,緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白及m RNA降低,HIF-1α對VEGF轉錄活性顯著增高。與溶劑對照組相比,Minocycline劑量依賴性的降低伊文思藍和膠體金通透性,增加內皮細胞TEER,下調MMP9、MMP2和VEGF蛋白及m RNA表達,但Minocycline僅能上調HIF-1α蛋白而非m RNA表達,Minocycline能同時上調ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白及m RNA表達。然而,HIF-1α抑制劑YC-1或穩(wěn)定劑DMOG均能調控Minocycline引起的上述變化。與常氧組相比,缺氧誘導HIF-1α上調的同時顯著下調SIRT-3和PHD-2蛋白表達,與缺氧組相比,Minocycline抑制HIF-1α同時上調SIRT-3和PHD-2蛋白表達,SIRT-3敲降后Minocycline對HIF-1α的抑制作用減弱,SIRT-3和PHD-2顯著上調。結論1.急性缺氧可引起大鼠飲水量減少,嚴重的急性缺氧可損傷大鼠血腦屏障。2.急性缺氧大鼠飲水減少與中腦SFO區(qū)神經(jīng)元TRPV4開放密切相關。TRPV4與HO-2在SFO區(qū)神經(jīng)元細胞膜上以復合體的形式存在。缺氧時,大鼠飲水減少有可能是通過HO-2感知氧分壓變化、開放效應分子TRPV4引起中樞SFO區(qū)神經(jīng)元胞漿[Ca2+]i升高,進而抑制口渴中樞所致。3.急性缺氧引起小分子蛋白Adropin表達增高參與大鼠飲水減少的機制。Adropin通過作用于中樞CVOs區(qū)TRPV4鈣離子通道,引起其下游鈣離子相關的Camkk-AMPK信號通路磷酸化,活化TRPV4渴覺抑制性神經(jīng)元,減少大鼠飲水量。4.嚴重缺氧損傷血腦屏障,Minocycline通過激活SIRT-3/PHD-2信號通路,促進HIF-1α降解,使HIF-1α介導的VEGF、MMP-2、MMP-9表達減少,而內皮細胞間的緊密連接蛋白表達上調,保護血腦屏障。實驗結果提示:在進入高原后的早期,飲水減少是中樞神經(jīng)主動抑制的結果。對于急進特高海拔或嚴重缺氧的人來講,Minocycline可望成為防治高原腦水腫的潛在藥物。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R82

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