本文關(guān)鍵詞： 血腦屏障 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病 膜聯(lián)蛋白A2 創(chuàng)傷性腦外傷 連接復(fù)合體 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 ARF6　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景血腦屏障主要是指單層的血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的腦毛細(xì)血管壁,其能夠選擇性地使血液中的溶質(zhì)進(jìn)入到腦組織中,為腦組織創(chuàng)造了一個健康的微環(huán)境,對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理活動有重要的作用。創(chuàng)傷性腦外傷作為血腦屏障損傷最嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,已經(jīng)成為世界上高致死率和致殘率的主要疾病�；颊咴谀X外傷后,血腦屏障的功能失調(diào),使血液中大量的炎癥分子進(jìn)入到腦組織,造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的二次損傷,是創(chuàng)傷性腦外傷治療的難點(diǎn)所在。到目前為止,已經(jīng)報(bào)道過有很多分子通路參與·了生理狀態(tài)下血腦屏障的功能調(diào)控,但是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病狀態(tài)下參與血腦屏障功能調(diào)控的分子十分有限。膜聯(lián)蛋白(Annexins)家族是鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族,膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2)作為其中的一個重要成員,在自身免疫疾病、出血綜合癥以及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,但其在血腦屏障中的作用目前尚不清楚。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A1(Annexin Al)能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的骨架分布以及細(xì)胞間的緊密程度。由于Annexins家族具有高度保守的功能結(jié)構(gòu)域,而膜聯(lián)蛋白A2也參與調(diào)控細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(內(nèi)吞和胞吐),故在本研究中,我們提出假設(shè)：膜聯(lián)蛋白A2是一個調(diào)控血腦屏障功能的重要分子,是一個治療因血腦屏障失調(diào)導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在靶點(diǎn)。本研究的闡明,為篩選治療創(chuàng)傷性腦外傷潛在的分子靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ),為設(shè)計(jì)更加高效地保護(hù)血腦屏障功能失調(diào)的藥物提供了新的方向,具有重要的臨床意義,是當(dāng)前迫切需要探索和解決的重要科學(xué)前沿問題。研究方法胚胎期血腦屏障功能測定孕鼠吸入麻醉后,將胚胎暴露,臍帶仍然和母體相連,使用Hmailton注射器將5μl示蹤劑注射進(jìn)入胚胎的肝臟中(4 mg/ml),使染料通過肝臟循壞三分鐘,然后取胚胎腦組織放入4%多聚甲醛中,冷室過夜,次日放入30%蔗糖溶液中脫水。成年鼠血腦屏障功能測定小鼠吸入麻醉后,暴露心臟,將10-15 ml EZ連接NHS磺基生物素(0.5 mg/ml)通過左心室注入,循環(huán)五分鐘后,使用磷酸鹽緩沖生理鹽水(Phosphate buffered saline, PBS)灌注。取出腦組織放入4%多聚甲醛中,冷室過夜,次日放入30%蔗糖溶液中脫水。受控皮質(zhì)沖擊手術(shù)模型暴露解剖標(biāo)志LAMBDA (尾椎方面)和前囟門(正面的方面)。在LAMBDA和前囟門和(1毫米遠(yuǎn)離中線)繪制中心圓(直徑5毫米)。使用鉆孔沿標(biāo)記的圓圈切割,鑷子去除骨暴露硬腦膜。致動器的速度：5米／秒；變形深度：0.6毫米；調(diào)節(jié)筆尖(直徑3毫米)在平行于沖擊部位的表面的角度。細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn)將HBMEC接種于膠原蛋白鋪墊過的1.0μm遷移小室中,將小室置于24孔板中,給藥處理后,加入辣根過氧化物酶至小室的培養(yǎng)基中,終濃度為100 μg/ml;60分鐘后,收集小室下面孔中的培養(yǎng)基,加入鄰甲氧基苯酚和雙氧水,至終濃度為0.5 mM(鄰甲氧基苯酚),0.6 mM(雙氧水)。顯色后,在吸收波長為490 nm的酶標(biāo)儀中測量從小室中滲漏出的辣根過氧化物酶的量。研究結(jié)果1.膜聯(lián)蛋白A2在血腦屏障功能形成和成熟中的重要作用在野生型小鼠和A2-/-小鼠胚胎期13.5天,10 kDa的示蹤劑已經(jīng)聚集于野生型小鼠的腦血管中,沒有滲漏現(xiàn)象。在A2-/-小鼠皮層位置,卻觀察到該示蹤劑有滲漏現(xiàn)象。在A2-/-小鼠胚胎期15.5天,10kDa示蹤劑也聚集于腦血管中,表明隨著發(fā)育,A2-/-小鼠的血腦屏障功能也在完善。值得注意的是,在A2-/-小鼠胚胎期15.5天,550 Da小分子示蹤劑仍然存在滲漏,野生型小鼠卻沒有滲漏。在出生后4天以及成年12周的野生型小鼠和A2-/-小鼠的腦組織中,也觀察到了同樣的現(xiàn)象。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示膜聯(lián)蛋白A2參與血腦屏障功能形成和成熟,并且膜聯(lián)蛋白A2的缺失會導(dǎo)致血腦屏障對小分子的滲漏增加。提取三個月大的野生型小鼠和A2-/-小鼠的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,分析連接復(fù)合體的表達(dá)水平。結(jié)果表明,與野生型小鼠比較,緊密連接蛋白：ZO-1、Claudin-5、粘附連接蛋白VE-cadherin的表達(dá)在A2-/-小鼠腦微血管中明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)證明膜聯(lián)蛋白A2的缺失會造成血腦屏障的功能失調(diào)。2.膜聯(lián)蛋白A2對創(chuàng)傷性血腦屏障損傷的保護(hù)作用受控皮質(zhì)沖擊手術(shù)(Controlled cordical impact models, CCI)后24小時,通過尾靜脈注射10 kDa的熒光示蹤劑可以發(fā)現(xiàn)A2-/-小鼠血管滲漏的程度高于野生型小鼠。在埃文斯藍(lán)測定血腦屏障功能的實(shí)驗(yàn)中,也得到了相似的結(jié)果。隨后提取腦血管內(nèi)皮細(xì)胞,對連接復(fù)合體的表達(dá)進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)相對于野生型小鼠,A2-/-小鼠中緊密連接蛋白：ZO-1、Occludin、Claudin-5、粘附連接蛋白：VE-cadherin的表達(dá)均明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)均表明膜聯(lián)蛋白A2的缺失造成了腦外傷對血腦屏障更嚴(yán)重的損傷。CCI手術(shù)后2小時,尾靜脈注射不同劑量的重組膜聯(lián)蛋白A2(Recombinant annexin A2, rA2),結(jié)果顯示相對于牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum, BSA)對照組,給予rA2 (0.75 mg/kg-1.5 mg/kg)能有效地降低血管的滲漏。更重要的是,即使在CCI手術(shù)后6小時給予rA2 (1 mg/kg)也能有效地降低血管的滲漏。同時,CCI手術(shù)后1小時給予rA2 (1 mg/kg)的治療能有效地增加緊密連接蛋白：ZO-1和粘附連接蛋白：VE-cadherin的表達(dá)。以上均證明了重組膜聯(lián)蛋白A2能夠有效的逆轉(zhuǎn)腦外傷造成的血腦屏障功能失調(diào),并且增加連接復(fù)合體的蛋白表達(dá)水平。在體外試驗(yàn)中,使用小干擾RNA (Small interfering RNA, siRNA)將人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human brain microvascular endothelial cell, HBMEC)中膜聯(lián)蛋白A2表達(dá)沉默,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間的滲透性顯著高于對照組。在單層緊密的HBMEC中加入炎癥分子白介素-1β (Interlukin 1β, IL-1β),細(xì)胞的滲透性顯著增加,而rA2可以逆轉(zhuǎn)這種損傷。進(jìn)一步,創(chuàng)傷性腦外傷在體外模擬模型：IL-1β+缺氧混合模型能明顯增加HBMEC的滲透性,而rA2也能逆轉(zhuǎn)這種損傷。提取HBMEC的細(xì)胞膜蛋白,并對連接復(fù)合體的表達(dá)進(jìn)行了檢測。Ⅲ-1β+缺氧能降低所有連接復(fù)合體蛋白的表達(dá),而給予rA2后,能顯著增加ZO-1和VE-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)表明,rA2通過影響ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)以及在細(xì)胞中的分布來保護(hù)Ⅲ-1β+缺氧造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透增加。3.膜聯(lián)蛋白A2對創(chuàng)傷性血腦屏障損傷的保護(hù)作用機(jī)制提取人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜蛋白,使用膜聯(lián)蛋白A2的特異性單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)。結(jié)果顯示膜聯(lián)蛋白A2能夠和細(xì)胞膜上粘附連接蛋白VE-cadherin以及細(xì)胞骨架蛋白F-actin相互結(jié)合。IL-1β+缺氧能夠減少膜聯(lián)蛋白A2在HBMEC胞膜上的分布,而給予rA2后,細(xì)胞膜上膜聯(lián)蛋白A2的量明顯增加。這也導(dǎo)致膜聯(lián)蛋白A2和VE-cadherin、F-actin的相互作用增加,進(jìn)而穩(wěn)定VE-cadherin和F-actin在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的分布,增加細(xì)胞的緊密連接性。IL-1β+缺氧明顯激活了小G蛋白酶ARF6,而rA2能夠抑制ARF6的激活。利用siRNA沉默內(nèi)源性膜聯(lián)蛋白A2的表達(dá),細(xì)胞內(nèi)的ARF6被明顯激活。使用ARF6的特異性激活劑QS11能降低連接復(fù)合體的表達(dá)水平,而rA2能夠逆轉(zhuǎn)ZO-1和VE-cadherin的減少。使用ARF6的特異性抑制劑SecinH3,能夠抑制IL-1β+缺氧造成的ZO-1和VE-cadherin在細(xì)胞膜上表達(dá)的降低,而rA2的作用并沒有強(qiáng)于SecinH3+rA2組保護(hù)作用。以上實(shí)驗(yàn)表明：rA2調(diào)控血腦屏障連接復(fù)合體的表達(dá)主要依賴于ARF6通路。研究結(jié)論膜聯(lián)蛋白A2參與血腦屏障功能的形成和成熟,膜聯(lián)蛋白A2的缺失使胚胎期血腦屏障出現(xiàn)損傷,并且該損傷能伴隨至成年。在生理情況造成小分子的滲漏,也會加重創(chuàng)傷性腦外傷導(dǎo)致的血腦屏障損傷。外源給予重組的膜聯(lián)蛋白A2能夠保護(hù)創(chuàng)傷性腦外傷造成的血腦屏障滲漏,避免二次損傷的發(fā)生。膜聯(lián)蛋白A2能通過和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的粘附連接蛋白VE-cadherin.細(xì)胞骨架蛋白F-actin相互作用,穩(wěn)定它們在膜上的分布。同時,外源性給予重組膜聯(lián)蛋白A2能抑制ARF6分子的活化從而增加連接復(fù)合體在膜上的表達(dá),增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接性。該研究不僅拓展了膜聯(lián)蛋白A2的功能以及其作用機(jī)制,更為以后對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路和方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R651.15

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