本文關(guān)鍵詞： 益氣化瘀解毒方 結(jié)腸癌 腫瘤干細(xì)胞 固有免疫　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:腸癌轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征,是醫(yī)學(xué)研究的重大課題,從現(xiàn)有的國際國內(nèi)的研究進(jìn)展來看,腫瘤的轉(zhuǎn)移可能一方面與腫瘤干細(xì)胞相關(guān),另一方面與機(jī)體的免疫力相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察中醫(yī)藥"益氣化瘀解毒"方對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的影響,并從結(jié)腸癌干細(xì)胞及荷瘤鼠的固有免疫這兩個方面進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。研究方法:1、選取復(fù)方中的中藥單體,構(gòu)建HPLC方法檢測復(fù)方水煎劑中對應(yīng)物質(zhì)的含量,為中藥的質(zhì)控奠定基礎(chǔ)。2、檢測多株結(jié)腸癌細(xì)胞株的細(xì)胞表面CD133和CD44分子,明確其表達(dá)情況。3、體外分選CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞和CD133和CD44同時低表達(dá)的細(xì)胞,比較其干性和分化標(biāo)志物的核酸水平、細(xì)胞周期的異同、無血清培養(yǎng)條件下的克隆球形成的能力、恢復(fù)血清后的細(xì)胞分化能力、軟瓊脂克隆形成能力;進(jìn)而進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),將分選得到的CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞和CD133和CD44同時低表達(dá)的細(xì)胞分別接種于裸鼠腋下,3周后比較其成瘤能力,同時再次檢測瘤組織內(nèi)細(xì)胞表面的CD44和CD133的表達(dá)情況。4、使用培養(yǎng)基中直接加藥的方法考查體外"益氣化瘀解毒"方對結(jié)腸癌干細(xì)胞的影響。使用裸鼠脾臟接種結(jié)腸癌細(xì)胞,灌胃"益氣化瘀解毒"方3周后,流式檢測脾臟中結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的比例。5、"益氣化瘀解毒"方對裸鼠皮下移植瘤的影響,比較中藥干預(yù)3周后的移植瘤的大小和其他一般情況。6、通過在裸鼠結(jié)腸原位接種相同體積的熒光標(biāo)記的結(jié)腸癌組織塊,比較陰性對照組、"益氣化瘀解毒"方組、5-Fu組及中西醫(yī)結(jié)合組的結(jié)腸癌種植轉(zhuǎn)移的情況。7、通過在裸鼠脾臟注射相同數(shù)目的熒光標(biāo)記的結(jié)腸癌細(xì)胞,比較陰性對照組、"益氣化瘀解毒"方組、5-Fu組及中西醫(yī)結(jié)合組的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的情況。8、通過流式細(xì)胞術(shù)分析"益氣化瘀解毒"方對裸鼠外周血和脾臟的固有免疫細(xì)胞(NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)的影響。9、通過細(xì)胞因子芯片的高通量篩選,比較"益氣化瘀解毒"方干預(yù)3周后對造模裸鼠血漿細(xì)胞因子的影響。10、通過流式細(xì)胞術(shù)比較使用"益氣化瘀解毒"方干預(yù)后對裸鼠的巨噬細(xì)胞的影響。研究結(jié)果:1、建立了 HPLC方法,在中藥復(fù)方中成功檢測出了尿囊素、毛蕊異黃酮苷、甘草苷、甘草酸,為中藥復(fù)方的質(zhì)控奠定了基礎(chǔ)。2、在人結(jié)腸癌細(xì)胞株CaCo-2、HT-29、SW480、SW620、LoVo、HCT-116中,只有HCT-116這株細(xì)胞是具有較高比例的CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞亞群。3、體外實(shí)驗(yàn)使用流式分選得到CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞以及CD133和CD44同時低表達(dá)的細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)前者中干性標(biāo)志(CD133、ALDH2和Lgr5)也高表達(dá),而分化指標(biāo)CK20為低表達(dá)(p0.05);細(xì)胞周期檢測顯示CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞更多地處于GO/G1期,無血清培養(yǎng)和軟瓊脂培養(yǎng)顯示其有更強(qiáng)的克隆球形成能力,恢復(fù)血清后,其克隆球又能恢復(fù)多形性的貼壁細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為注射分選得到的不同的亞群細(xì)胞進(jìn)行皮下成瘤實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞的皮下成瘤能力更強(qiáng),注射105和104個細(xì)胞時,100%成瘤,注射103個細(xì)胞仍有4/9只成瘤,比CD133和CD44同時低表達(dá)的細(xì)胞組高出一倍,同時瘤重也較重;另外在瘤組織重新研磨后檢測CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞亞群比例上,注射105組為6.8%±1.8%(v.s.2.6%±0.8%,p0.05),說明了 CD133和CD44共同高表達(dá)的細(xì)胞是HCT-116細(xì)胞株中的腫瘤干細(xì)胞。4、體外實(shí)驗(yàn)考查了益氣化瘀解毒方對結(jié)腸癌干細(xì)胞的影響,在培養(yǎng)基中直接加入中藥復(fù)方干預(yù),CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞亞群比例變化不大,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)造模脾臟注射結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的模型,對復(fù)方中藥灌胃后的脾臟原位瘤的CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞亞群比例改變影響有限(14.97%± 8.08%v.s.13.75%± 6.93%,p=0.790)。5、在皮下移植瘤模型中,益氣化瘀解毒方干預(yù)3周后,與陰性對照組、5-Fu對照組及中藥小劑量聯(lián)合5-Fu組相比,中藥的大、小劑量組的裸鼠體重沒有明顯變化(p0.05),皮下移植瘤的重量雖有下降,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。6、使用在裸鼠結(jié)腸組織原位移植熒光標(biāo)記的結(jié)腸癌組織的方法,觀察益氣化瘀解毒方干預(yù)3周后的效果,其種植轉(zhuǎn)移率分別為:陰性對照組33.3%,5-Fu對照組28.6%,中藥組0%,中藥聯(lián)用5-Fu組0%,但由于例數(shù)較少,故經(jīng)卡方檢驗(yàn),p0.05。7、構(gòu)建脾臟注射熒光標(biāo)記的HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的模型,益氣化瘀解毒方干預(yù)后,其體重各組間無明顯差異,存活率5-Fu組最低(66.7%),肝轉(zhuǎn)移率為:陰性對照組90.9%(10/11只),5-Fu對照組71.4%(5/7只),中藥組44.4%(4/9只),中藥聯(lián)用5-Fu組30.0%(3/10只),與陰性組相比,中藥組和中藥聯(lián)合5-Fu組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。8、在上述結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的基礎(chǔ)上,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測益氣化瘀解毒方干預(yù)后的裸鼠外周血與脾臟中的NK細(xì)胞活化率、巨噬細(xì)胞含量和中性粒細(xì)胞含量,發(fā)現(xiàn)在外周血的中性粒細(xì)胞占粒細(xì)胞設(shè)門位置里CD45+細(xì)胞的含量方面,益氣化瘀解毒方組明顯高于陰性對照組(77.09%± 12.55%v.s.61.76%± 11.51%),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。9、細(xì)胞因子芯片檢測益氣化瘀解毒方干預(yù)后的裸鼠外周血血漿,發(fā)現(xiàn)GM-CSF、γ-IFN、IL-1a、IL-3、IL-6、IL-13、IL-17水平高于陰性對照組2倍以上。10、使用無荷瘤裸鼠直接中藥干預(yù)模型,發(fā)現(xiàn)益氣化瘀解毒方干預(yù)2周后,與陰性組相比,脾臟的巨噬細(xì)胞比例明顯增加,2.09%±0.42%v.s.1.28%±0.26%,p0.05。同時發(fā)現(xiàn)拆方的扶正治療組和祛邪治療組與陰性組相比,均不能達(dá)到有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。研究結(jié)論:益氣化瘀解毒方能通過激活機(jī)體的固有免疫系統(tǒng),尤其是通過增加中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的含量,迅速殺滅游走于血液系統(tǒng)中的脫離原發(fā)灶的結(jié)腸癌細(xì)胞,達(dá)到減少結(jié)腸癌種植轉(zhuǎn)移和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的目的,體現(xiàn)了中醫(yī)理論中"益氣"的指導(dǎo)思想。結(jié)腸癌細(xì)胞中的CD133和CD44同時高表達(dá)細(xì)胞是其腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志,而益氣化瘀解毒方對其影響有限,提示中藥復(fù)方可能不是通過這個途徑達(dá)到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。拆方的研究顯示了該復(fù)方的構(gòu)成具有特殊性,"扶正"和"祛邪"缺一不可,體現(xiàn)了中藥復(fù)方的獨(dú)特效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：1515813