本文關(guān)鍵詞： microRNA-17-92 慢性粒細(xì)胞白血病 c-Myc 腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3 NF-κB　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是原癌蛋白BCR-ABL作用于造血干細(xì)胞(HSC)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的一類克隆增殖性血液疾病。BCR-ABL融合基因編碼的BCR-ABL融合蛋白促進(jìn)酪氨酸激酶(TK)過度表達(dá),TK主要催化蛋白質(zhì)酪氨酸酶酸化作用而激活多條細(xì)胞傳導(dǎo)途徑,加速細(xì)胞增殖和阻礙細(xì)胞凋亡。目前CML治療主要包括骨髓移植、基因治療、免疫治療和分子靶向治療,尤其是分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKI)備受矚目。TKI是以阻斷BCR-ABL調(diào)控的惡性轉(zhuǎn)化為靶點(diǎn)的抑制劑,而且TKI低毒不影響正常細(xì)胞,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床治療。然而,藥物耐受問題和TKI對(duì)白血病干細(xì)胞不靈敏性導(dǎo)致的復(fù)發(fā)一直阻礙著徹底治愈CML最終理想的實(shí)現(xiàn)。因此,深入探索CML白血病干細(xì)胞的生物學(xué)基礎(chǔ)和TKI耐藥的分子機(jī)制有助于尋找靶向治療的新靶點(diǎn)。micro RNA(miRNA)是一個(gè)長(zhǎng)約21nt-23nt的類非編碼的小分子單鏈RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá),并且參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化等細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)節(jié),以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miRNA參與腫瘤的發(fā)生主要是通過靶分子識(shí)別、miRNAs突變以及扮演癌基因或抑癌基因角色實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)眾多miRNA參與轉(zhuǎn)化HSC過程,在CML中表達(dá)上調(diào)或下調(diào),并且調(diào)控CML演變中相關(guān)靶基因和信號(hào)通路,從而影響CML的發(fā)生發(fā)展。miR-17-92基因簇也稱oncomir-1,其基因位于人13q31.3,在血液系統(tǒng)腫瘤和骨髓瘤中存在突變和擴(kuò)增。前期我們對(duì)CML CD34+細(xì)胞進(jìn)行基因芯片和探針Q-PCR篩查發(fā)現(xiàn)miR-17-92中的miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92六個(gè)成熟miRNA表達(dá)升高,但miR-17-92在CML發(fā)病中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究利用miR-17-92基因條件敲除小鼠,結(jié)合BCR-ABL轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的CML模型,評(píng)價(jià)miR-17-92簇在CML中的作用及機(jī)制。首先,我們闡明CML中c-Myc通路調(diào)控miR-17-92誘導(dǎo)的BCR-ABL活性。利用si RNA沉默技術(shù)和Lipofectamine?3000,c-Myc si RNA轉(zhuǎn)染CML細(xì)胞系KCL22細(xì)胞。Q-PCR法檢測(cè)c-Myc表達(dá),再利用Taqman探針定量PCR法檢測(cè)miR-17-92表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)si RNA沉默c-Myc后KCL22細(xì)胞中miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b表達(dá)明顯下調(diào)。以上結(jié)果證實(shí)c-Myc調(diào)控了BCR-ABL誘導(dǎo)的miR-17-92表達(dá)上調(diào)。其次,我們確定miR-17-92在CML細(xì)胞增殖和凋亡中的調(diào)控角色。將miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92抑制劑轉(zhuǎn)染CML細(xì)胞系K562細(xì)胞,利用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin-V APC/PI染色的細(xì)胞凋亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-17-92抑制劑減少細(xì)胞增殖和增加細(xì)胞凋亡。結(jié)果說明在CML中miR-17-92發(fā)揮促癌基因作用。再次,我們通過將表達(dá)BCR-ABL融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染miR-17-92敲除小鼠骨髓細(xì)胞并建立CML小鼠模型,明確miR-17-92在BCR-ABL誘導(dǎo)的白血病生成和發(fā)展中的相關(guān)作用。利用Q-PCR檢測(cè)miR-17-92敲除小鼠骨髓細(xì)胞中miR-17-92簇敲除效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除小鼠骨髓細(xì)胞中miR-17,miR-18a,miR-19a,miR-20a,miR-19b和miR-92表達(dá)比野生型(WT)小鼠明顯下調(diào)。敲除小鼠中B細(xì)胞減少,說明miR-17-92對(duì)B細(xì)胞生長(zhǎng)很重要并不影響骨髓造血作用。WT小鼠和miR-17-92敲除小鼠作為供體小鼠,移植前通過尾靜脈注射5-FU。將兩組供體小鼠骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng),給予造血生長(zhǎng)因子預(yù)刺激和BCR-ABL逆轉(zhuǎn)病毒(P210)的感染,分別通過尾靜脈注射移植于經(jīng)過γ射線照射過的的同種正常受體小鼠。建模后對(duì)兩組小鼠進(jìn)行體征觀察,血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)外周血白細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞GFP表達(dá),并對(duì)發(fā)病小鼠肝臟、脾臟進(jìn)行稱重和病理檢測(cè)。CML模型結(jié)果顯示出兩組差異性,一組是移植P210感染的miR-17-92敲除小鼠骨髓細(xì)胞組(K組),另一組是移植P210感染的WT小鼠骨髓細(xì)胞組(N組)。所有接受P210感染細(xì)胞的移植小鼠都發(fā)展成CML并在30天內(nèi)出現(xiàn)外周血中GFP高表達(dá)。N組小鼠外周血中GFP表達(dá)比K組升高,N組小鼠白細(xì)胞升高也早于K組小鼠。發(fā)病小鼠脾臟代償性增大,而K組小鼠脾臟重量大于N組小鼠脾臟,病檢發(fā)現(xiàn)兩組發(fā)病小鼠肝脾正常結(jié)構(gòu)破壞,肝臟組織中肝小葉結(jié)構(gòu)不完整,肝束排列擁擠,彌漫可見巢狀淋巴樣組織浸潤(rùn)并伴有圓形或卵圓形淋巴樣細(xì)胞,脾臟組織中白髓明顯增多,紅髓明顯減少,明顯可見白細(xì)胞成分。經(jīng)過對(duì)CML模型小鼠存活率的統(tǒng)計(jì),K組小鼠存活率明顯提高,移植后70天具有30%以上存活,而N組移植后40天內(nèi)全部死亡。以上結(jié)果證實(shí)了沉默miR-17-92抑制CML中BCR-ABL致癌性轉(zhuǎn)化的活性,延遲了CML發(fā)病。最后,闡明miR-17-92調(diào)控白血病生成機(jī)制。我們鑒定CML細(xì)胞中A20(TNFAIP3)作為miR-19b靶基因。Q-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)K組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中A20表達(dá)比N組上調(diào)。利用Target Scan在線分析軟件預(yù)測(cè)特異性靶向A20基因3’-UTR的miRNA包括miR-18a、miR-19a和miR-19b,通過退火、酶切和膠回收后構(gòu)建報(bào)告基因載體p GL3-A20-miR-18和p GL3-A20-miR-19a/b,分別與miR-18a、miR-19a和miR-19b mimic共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法結(jié)果顯示A20 3’-UTR miR-19b組熒光素酶活性明顯降低。WB結(jié)果證明K562和KCL22細(xì)胞中miR-19b抑制劑、伊馬替尼(Imatinib)上調(diào)A20表達(dá),相反過表達(dá)miR-17-92下調(diào)A20表達(dá)。Q-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A20在CML CD34+細(xì)胞中表達(dá)比正常人CD34+中下降,而經(jīng)Imatinib處理后升高。以上結(jié)果提示CML細(xì)胞中A20表達(dá)下調(diào)依賴BCR-ABL的活性。明確A20調(diào)控CML細(xì)胞增殖和存活作用。磷酸鈣沉淀法包裝過表達(dá)A20慢病毒并感染K562、KCL22和CML CD34+細(xì)胞進(jìn)行鑒定,Q-PCR和WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)慢病毒組A20表達(dá)升高,提示慢病毒包裝成功。過表達(dá)A20慢病毒感染CML CD34+細(xì)胞,利用Dye670、Hoechst33342、Annexin-V APC/PI染色和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期和凋亡,并用半固體培養(yǎng)基體外培養(yǎng)BFU-E和CFU-GM,CFU-GEMM集落,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)A20抑制增殖和集落形成,增加細(xì)胞周期G0/G1期比例、降低S期比例,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡增加。由此說明A20在CML細(xì)胞中具有抑癌基因作用。為了探索A20影響CML細(xì)胞特性的機(jī)制,我們將過表達(dá)A20和miR-17-92慢病毒感染CML細(xì)胞。WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)A20減少K562、CML CD34+細(xì)胞P65、IκBa磷酸化表達(dá),過表達(dá)miR-17-92增加K562細(xì)胞P65、IκBa磷酸化表達(dá),而在KCL22細(xì)胞中變化不明顯。因此,CML中A20通過抑制P65、IκBa磷酸化表達(dá)而負(fù)調(diào)控NF-kB信號(hào)通路。綜上所述,我們證明了miR-17-92通過靶基因A20調(diào)控NF-κB參與BCR-ABL誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和CML發(fā)病。本研究闡明miR-17-92促進(jìn)CML發(fā)生的調(diào)控機(jī)制具有一定的創(chuàng)新性,為今后miR-17-92基因靶向治療CML提供新的策略。
[Abstract]:The expression of miR - 17 , miR - 18a , miR - 19a , miR - 20a , miR - 19b and miR - 92 in CML has been investigated . The expression of miR - 17 - 92 in mouse bone marrow cells was significantly lower than that of wild type ( WT ) mice . In order to explore the mechanism of inhibiting the expression of P65 and I魏B in CML cells , the expression of P65 and I魏B in CML cells was detected .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.72

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本文編號(hào)：1506816