本文關(guān)鍵詞： microRNA-17-92 慢性粒細胞白血病 c-Myc 腫瘤壞死因子α誘導蛋白3 NF-κB　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：慢性粒細胞白血病(CML)是原癌蛋白BCR-ABL作用于造血干細胞(HSC)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的一類克隆增殖性血液疾病。BCR-ABL融合基因編碼的BCR-ABL融合蛋白促進酪氨酸激酶(TK)過度表達,TK主要催化蛋白質(zhì)酪氨酸酶酸化作用而激活多條細胞傳導途徑,加速細胞增殖和阻礙細胞凋亡。目前CML治療主要包括骨髓移植、基因治療、免疫治療和分子靶向治療,尤其是分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKI)備受矚目。TKI是以阻斷BCR-ABL調(diào)控的惡性轉(zhuǎn)化為靶點的抑制劑,而且TKI低毒不影響正常細胞,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床治療。然而,藥物耐受問題和TKI對白血病干細胞不靈敏性導致的復發(fā)一直阻礙著徹底治愈CML最終理想的實現(xiàn)。因此,深入探索CML白血病干細胞的生物學基礎(chǔ)和TKI耐藥的分子機制有助于尋找靶向治療的新靶點。micro RNA(miRNA)是一個長約21nt-23nt的類非編碼的小分子單鏈RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達,并且參與細胞增殖、凋亡和分化等細胞生物學進程的調(diào)節(jié),以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miRNA參與腫瘤的發(fā)生主要是通過靶分子識別、miRNAs突變以及扮演癌基因或抑癌基因角色實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)眾多miRNA參與轉(zhuǎn)化HSC過程,在CML中表達上調(diào)或下調(diào),并且調(diào)控CML演變中相關(guān)靶基因和信號通路,從而影響CML的發(fā)生發(fā)展。miR-17-92基因簇也稱oncomir-1,其基因位于人13q31.3,在血液系統(tǒng)腫瘤和骨髓瘤中存在突變和擴增。前期我們對CML CD34+細胞進行基因芯片和探針Q-PCR篩查發(fā)現(xiàn)miR-17-92中的miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92六個成熟miRNA表達升高,但miR-17-92在CML發(fā)病中的作用及機制尚不清楚。本研究利用miR-17-92基因條件敲除小鼠,結(jié)合BCR-ABL轉(zhuǎn)基因誘導的CML模型,評價miR-17-92簇在CML中的作用及機制。首先,我們闡明CML中c-Myc通路調(diào)控miR-17-92誘導的BCR-ABL活性。利用si RNA沉默技術(shù)和Lipofectamine?3000,c-Myc si RNA轉(zhuǎn)染CML細胞系KCL22細胞。Q-PCR法檢測c-Myc表達,再利用Taqman探針定量PCR法檢測miR-17-92表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)si RNA沉默c-Myc后KCL22細胞中miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b表達明顯下調(diào)。以上結(jié)果證實c-Myc調(diào)控了BCR-ABL誘導的miR-17-92表達上調(diào)。其次,我們確定miR-17-92在CML細胞增殖和凋亡中的調(diào)控角色。將miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92抑制劑轉(zhuǎn)染CML細胞系K562細胞,利用CCK-8檢測細胞增殖,流式細胞儀檢測Annexin-V APC/PI染色的細胞凋亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-17-92抑制劑減少細胞增殖和增加細胞凋亡。結(jié)果說明在CML中miR-17-92發(fā)揮促癌基因作用。再次,我們通過將表達BCR-ABL融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染miR-17-92敲除小鼠骨髓細胞并建立CML小鼠模型,明確miR-17-92在BCR-ABL誘導的白血病生成和發(fā)展中的相關(guān)作用。利用Q-PCR檢測miR-17-92敲除小鼠骨髓細胞中miR-17-92簇敲除效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除小鼠骨髓細胞中miR-17,miR-18a,miR-19a,miR-20a,miR-19b和miR-92表達比野生型(WT)小鼠明顯下調(diào)。敲除小鼠中B細胞減少,說明miR-17-92對B細胞生長很重要并不影響骨髓造血作用。WT小鼠和miR-17-92敲除小鼠作為供體小鼠,移植前通過尾靜脈注射5-FU。將兩組供體小鼠骨髓細胞體外培養(yǎng),給予造血生長因子預刺激和BCR-ABL逆轉(zhuǎn)病毒(P210)的感染,分別通過尾靜脈注射移植于經(jīng)過γ射線照射過的的同種正常受體小鼠。建模后對兩組小鼠進行體征觀察,血細胞計數(shù)儀檢測外周血白細胞,流式細胞儀檢測外周血單個核細胞GFP表達,并對發(fā)病小鼠肝臟、脾臟進行稱重和病理檢測。CML模型結(jié)果顯示出兩組差異性,一組是移植P210感染的miR-17-92敲除小鼠骨髓細胞組(K組),另一組是移植P210感染的WT小鼠骨髓細胞組(N組)。所有接受P210感染細胞的移植小鼠都發(fā)展成CML并在30天內(nèi)出現(xiàn)外周血中GFP高表達。N組小鼠外周血中GFP表達比K組升高,N組小鼠白細胞升高也早于K組小鼠。發(fā)病小鼠脾臟代償性增大,而K組小鼠脾臟重量大于N組小鼠脾臟,病檢發(fā)現(xiàn)兩組發(fā)病小鼠肝脾正常結(jié)構(gòu)破壞,肝臟組織中肝小葉結(jié)構(gòu)不完整,肝束排列擁擠,彌漫可見巢狀淋巴樣組織浸潤并伴有圓形或卵圓形淋巴樣細胞,脾臟組織中白髓明顯增多,紅髓明顯減少,明顯可見白細胞成分。經(jīng)過對CML模型小鼠存活率的統(tǒng)計,K組小鼠存活率明顯提高,移植后70天具有30%以上存活,而N組移植后40天內(nèi)全部死亡。以上結(jié)果證實了沉默miR-17-92抑制CML中BCR-ABL致癌性轉(zhuǎn)化的活性,延遲了CML發(fā)病。最后,闡明miR-17-92調(diào)控白血病生成機制。我們鑒定CML細胞中A20(TNFAIP3)作為miR-19b靶基因。Q-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)K組骨髓單個核細胞中A20表達比N組上調(diào)。利用Target Scan在線分析軟件預測特異性靶向A20基因3’-UTR的miRNA包括miR-18a、miR-19a和miR-19b,通過退火、酶切和膠回收后構(gòu)建報告基因載體p GL3-A20-miR-18和p GL3-A20-miR-19a/b,分別與miR-18a、miR-19a和miR-19b mimic共轉(zhuǎn)染293細胞,雙熒光素酶報告基因檢測法結(jié)果顯示A20 3’-UTR miR-19b組熒光素酶活性明顯降低。WB結(jié)果證明K562和KCL22細胞中miR-19b抑制劑、伊馬替尼(Imatinib)上調(diào)A20表達,相反過表達miR-17-92下調(diào)A20表達。Q-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)A20在CML CD34+細胞中表達比正常人CD34+中下降,而經(jīng)Imatinib處理后升高。以上結(jié)果提示CML細胞中A20表達下調(diào)依賴BCR-ABL的活性。明確A20調(diào)控CML細胞增殖和存活作用。磷酸鈣沉淀法包裝過表達A20慢病毒并感染K562、KCL22和CML CD34+細胞進行鑒定,Q-PCR和WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達慢病毒組A20表達升高,提示慢病毒包裝成功。過表達A20慢病毒感染CML CD34+細胞,利用Dye670、Hoechst33342、Annexin-V APC/PI染色和流式細胞儀分別檢測細胞增殖、周期和凋亡,并用半固體培養(yǎng)基體外培養(yǎng)BFU-E和CFU-GM,CFU-GEMM集落,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達A20抑制增殖和集落形成,增加細胞周期G0/G1期比例、降低S期比例,并促進細胞凋亡增加。由此說明A20在CML細胞中具有抑癌基因作用。為了探索A20影響CML細胞特性的機制,我們將過表達A20和miR-17-92慢病毒感染CML細胞。WB檢測發(fā)現(xiàn)過表達A20減少K562、CML CD34+細胞P65、IκBa磷酸化表達,過表達miR-17-92增加K562細胞P65、IκBa磷酸化表達,而在KCL22細胞中變化不明顯。因此,CML中A20通過抑制P65、IκBa磷酸化表達而負調(diào)控NF-kB信號通路。綜上所述,我們證明了miR-17-92通過靶基因A20調(diào)控NF-κB參與BCR-ABL誘導的造血干細胞惡性轉(zhuǎn)化和CML發(fā)病。本研究闡明miR-17-92促進CML發(fā)生的調(diào)控機制具有一定的創(chuàng)新性,為今后miR-17-92基因靶向治療CML提供新的策略。
[Abstract]:The expression of miR - 17 , miR - 18a , miR - 19a , miR - 20a , miR - 19b and miR - 92 in CML has been investigated . The expression of miR - 17 - 92 in mouse bone marrow cells was significantly lower than that of wild type ( WT ) mice . In order to explore the mechanism of inhibiting the expression of P65 and I魏B in CML cells , the expression of P65 and I魏B in CML cells was detected .

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.72

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊瑞芳;陳麗娟;李建勇;;miR-17-92基因簇與腫瘤[J];中國實驗血液學雜志;2010年05期

相關(guān)博士學位論文 前3條

1 賈慶華;miR-17-92調(diào)控慢性粒細胞白血病發(fā)病作用及機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2017年

2 李逸塵;MiR-17-92對癌癥網(wǎng)絡(luò)中開關(guān)行為的影響[D];蘭州大學;2011年

3 劉梅;miR-17-92在食管癌中作用機制的初步研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2009年

相關(guān)碩士學位論文 前2條

1 劉京康;MiR-17-92簇在HPV陽性宮頸癌患者血清中的表達及其臨床意義[D];山東大學;2017年

2 馬玉潔;黃牛類胚胎干細胞分離培養(yǎng)及miR-17-92過表達對其靶基因表達的影響[D];廣西大學;2014年

，

本文編號：1506816