本文關鍵詞： 多柔比星 三陽血傣 骨髓抑制 心肌毒性 活性氧自由基 細胞凋亡 多柔比星 三陽血傣 p53 MAPK 凋亡　出處：《昆明醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分 SYKT對DOX誘導的骨髓抑制及心肌毒性的保護作用[目的]多柔比星(Doxorubicin, DOX)屬于蒽環(huán)類細胞毒藥物,廣泛用于各種惡性腫瘤的治療。但是它會引起嚴重的毒性反應,最常見的是出現(xiàn)骨髓抑制及心肌毒性。三陽血傣合劑(Sanyang Xuedai Mixture, SYKT)是來自于云南民間傣醫(yī)“四塔五蘊”理論及選自《貝葉經(jīng)》中傳統(tǒng)方劑,由生姜、血竭、山藥、甘草、茯苓、砂仁、三七、當歸等八味中草藥組成。相關研究顯示SYKT有多種生物學功能。本研究將探討SYKT是否能對DOX誘導的小鼠骨髓抑制及心肌毒性起到保護作用,并對其作用機制進行初步探討。[方法]C57BL/6J小鼠分別給予DOX單藥、SYKT單藥及聯(lián)合給藥。通過檢測外周血細胞、骨髓CD34+及CD44+細胞計數(shù),檢測細胞凋亡率來評估骨髓造血功能;通過檢測血清心肌酶、細胞凋亡率及形態(tài)學觀察來評估心功能,其中血清心肌酶指標包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate Aminotransferase, AST)、肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase,LDH),通過全自動生化分析儀檢測。通過流式細胞儀(Flow cytometry,FCM)檢測細胞凋亡率。通過HE染色及光學顯微鏡對心肌細胞形態(tài)學進行觀察。通過FCM檢測二氯熒光素強度來確定細胞內(nèi)活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)水平。[結(jié)果]通過對DOX單藥組小鼠的觀測,發(fā)現(xiàn)生存率減低,外周血細胞及骨髓CD34+及CD44+細胞計數(shù)減少,骨髓細胞凋亡率升高,表現(xiàn)為明顯骨髓抑制;另外血清心肌酶4項水平明顯升高,心肌細胞凋亡率增加,通過觀察心肌形態(tài)學發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)明顯空泡變性、心肌纖維溶解斷裂及單核巨噬細胞浸潤,表現(xiàn)為明顯的心肌受損及功能異常;然而聯(lián)合SYKT治療后以上指標均有不同程度好轉(zhuǎn),骨髓造血功能及心功能有所改善。此外,DOX單藥組小鼠骨髓細胞及心肌細胞中ROS的水平均明顯升高,且與細胞凋亡率成正比;而聯(lián)合SYKT后細胞ROS生成減少,細胞凋亡率減低。另外,通過對荷瘤小鼠皮下移植瘤體積大小及腫瘤細胞凋亡率的檢測證實SYKT在緩解骨髓抑制及心肌毒性的過程中并不影響DOX的抗腫瘤療效。本研究結(jié)果提示SYKT可能通過抑制ROS介導的細胞凋亡來緩解DOX誘導的骨髓抑制及心肌毒性。[結(jié)論]研究結(jié)果顯示SYKT可以緩解DOX誘導的小鼠骨髓抑制及心肌毒性,而且并未影響DOX的抗腫瘤療效。作用機制主要是通過抑制細胞中ROS的生成,從而減少了骨髓及心肌細胞的凋亡。因此聯(lián)合SYKT治療可能成為DOX化療中緩解患者骨髓抑制及心肌損傷的一種新的,安全有效的輔助治療方法。第二部分 SYKT緩解DOX誘導的心肌毒性的作用機制[目的]盡管多柔比星(Doxorubicin, DOX)是一種廣譜、有效的惡性腫瘤化療藥物,但因為常引起嚴重的心肌毒性而限制了它的臨床應用。三陽血傣(Sanyang Xuedai Mixture, SYKT)被報道具有多種生物學功能。本研究的目的是探討SYKT是否可作為一種有效的化療輔助藥物來逆轉(zhuǎn)DOX誘導的心肌毒性;如果可以,那么它保護效應的分子生物學作用機制又是什么。[方法]離體培養(yǎng)小鼠原代心肌細胞,通過肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac troponin I,CTnI)的免疫熒光染色來明確心肌細胞純度。通過western blot檢測心肌細胞中p53、p38、JNK 的活化,其中將 PFT-α、SB203580、SP600125 作為 p53、p38、JNK的特異性抑制劑,設為SYKT的陽性對照。通過細胞胞漿線粒體分離提取試劑盒,提取線粒體,分別提取胞漿及線粒體蛋白,通過western blot檢測心肌細胞胞漿及線粒體中Bax及細胞色素C的表達。通過羅丹明123染色及流式細胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)或激光掃描共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope, CLSM)檢測心肌細胞線粒體膜電位的變化。通過western blot檢測心肌細胞凋亡相關蛋白caspase-3及ADP核酸聚合酶(Poly ADP Ribose Polymerse,PARP)的表達。[結(jié)果]在小鼠心肌細胞中,DOX處理后引起前凋亡蛋白p53、p38、JNK活化,Bax轉(zhuǎn)位,干擾線粒體膜電位,介導caspase依賴的凋亡信號途徑,并引起心肌細胞凋亡。而聯(lián)合SYKT后,活化的p53、p38、JNK表達減少,Bax轉(zhuǎn)位減弱,線粒體膜電位趨于穩(wěn)定,細胞色素C釋放減少,凋亡相關蛋白caspase-3及PARP表達降低,心肌細胞凋亡明顯得到抑制。通過與陽性對照PFT-α、SB203580、SP600125對比,SYKT效果確切,提示SYKT可通過抑制p53及MAPKs活化阻止細胞凋亡途徑,起到心肌保護效應。[結(jié)論]本研究發(fā)現(xiàn)DOX通過活化p53及JNK-p38介導的細胞凋亡信號通路誘導了心肌細胞凋亡。SYKT可以有效的抑制這一過程。有望成為防治DOX誘導的嚴重心血管功能異常的安全有效的藥物。
[Abstract]:Objective : To evaluate the effects of SYKT on bone marrow suppression and myocardial toxicity in mice . The results suggest that SYKT can alleviate the inhibition of bone marrow suppression and myocardial toxicity by inhibiting the proliferation of bone marrow cells and myocardial cells . [鏂規(guī)硶]紱諱綋鍩瑰吇灝忛紶鍘熶唬蹇冭倢緇嗚優(yōu),閫氳繃鑲岄挋铔嬬櫧鈪，

本文編號：1493397