本文關(guān)鍵詞： 葫蘆二烯醇 羅漢果醇 羅漢果苷V 釀酒酵母 生物合成 藥理活性 AMPK 藥代動(dòng)力學(xué)　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：羅漢果甜苷,是一種葫蘆烷型三萜皂苷,不僅是傳統(tǒng)中藥羅漢果的主要活性成分,還是非糖類純天然甜味劑。藥理學(xué)研究表明羅漢果甜苷具有鎮(zhèn)咳祛痰、潤肺保肝,抗炎、抗癌、降血糖等作用,已成為為數(shù)不多的從中藥中發(fā)掘出來的具有治療功能的新型甜味劑。在羅漢果甜苷的生物合成途徑中,葫蘆二烯醇合酶是葫蘆烷型三萜骨架合成的第一個(gè)限速酶,也是此條途徑唯一的環(huán)化酶,可催化底物2,3-氧化鯊烯生成葫蘆二烯醇。隨后葫蘆二烯醇在P450酶和和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下,依次形成羅漢果醇和羅漢果苷。葫蘆二烯醇是葫蘆烷型三萜化合物羅漢果苷和葫蘆素的基本母核,具有抗炎、癌細(xì)胞防治功效,與很多萜類相似,葫蘆二烯醇在植物中的含量很低,因而限制了其規(guī)模化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。本文利用合成生物學(xué)方法在釀酒酵母中構(gòu)建葫蘆二烯醇合成途徑,經(jīng)途徑和發(fā)酵過程優(yōu)化,為實(shí)現(xiàn)葫蘆二烯醇及其下游產(chǎn)物的生物合成奠定了有利基礎(chǔ)。此外,還以羅漢果甜苷V及其前體羅漢果醇和葫蘆二烯醇為研究對(duì)象,進(jìn)行體外活性及大鼠血漿中藥代動(dòng)力學(xué)研究,為葫蘆烷型化合物的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。現(xiàn)將主要研究結(jié)果敘述如下:(1)構(gòu)建了葫蘆二烯醇酵母表達(dá)體系在對(duì)比酵母菌株生長速率、鯊烯底物的前提下,初步選擇改造實(shí)例豐富,代謝旺盛的優(yōu)勢酵母菌株BY4742作為底盤菌株。同源CS基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后導(dǎo)入釀酒酵母,實(shí)現(xiàn)了葫蘆二烯醇在釀酒酵母中的合成,而且表達(dá)SgCS基因獲得葫蘆二烯醇產(chǎn)量可達(dá)7.30 mg/L。(2)建立了多種代謝調(diào)控策略克隆到酵母轉(zhuǎn)錄因子UPC2基因,轉(zhuǎn)化到重組酵母菌株后,GC-MS分析產(chǎn)物發(fā)現(xiàn),過表達(dá)UPC2基因可提高葫蘆二烯醇產(chǎn)量,是出發(fā)菌株產(chǎn)量的3倍,為21.47mg/L。此外,外源物質(zhì)的添加對(duì)產(chǎn)物葫蘆二烯醇的合成具有一定的促進(jìn)作用,茉莉酸甲酯添加濃度為0.5 mg/L時(shí),產(chǎn)物葫蘆二烯醇與對(duì)照相比約增加了 50%;水楊酸添加濃度為0.5 mg/L時(shí),產(chǎn)物葫蘆二烯醇與對(duì)照相比約增加了 35%。(3)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)優(yōu)化了重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)葫蘆二烯醇的培養(yǎng)條件,發(fā)現(xiàn)以200 rpm,pH 5.0,空氣流量50 L/h在30℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)有利于酵母菌株生長和產(chǎn)物葫蘆二烯醇的積累。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵,結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵可顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物單位體積產(chǎn)量和菌株BY4742-SgCS的生物量,最終產(chǎn)物滴度為16 mg/L,約為對(duì)照組的2.8倍。此外,在補(bǔ)加葡萄糖的同時(shí)添加無機(jī)鹽溶液,可進(jìn)一步提高產(chǎn)物約25%,最終得到產(chǎn)物滴度為20 mg/L。(4)體外藥理活性腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性研究結(jié)果表明,羅漢果醇(MO)對(duì)A-549、BEL-7402和HL-60細(xì)胞均具有一定抑制作用;羅漢果苷V(MV)和葫蘆二烯醇(CU)對(duì)A-549細(xì)胞具有一定抑制作用,可作為候選藥物進(jìn)行后續(xù)研究。AMPK激活試驗(yàn)結(jié)果表明,受試物MO和MV在分子水平可以激活A(yù)MPK,MO的最大激活倍數(shù)和ECs0分別為2.3倍和4.2 μM;MV的最大激活倍數(shù)和ECs0分別為2.4倍和20.4 μM。這一發(fā)現(xiàn)為我們深入了解羅漢果甜苷的降糖機(jī)制提供了線索,并為天然AMPK激動(dòng)劑類新型抗糖尿病藥物的發(fā)現(xiàn)提供參考。(5)藥代動(dòng)力學(xué)研究建立了同時(shí)測定大鼠血漿中MV及其苷元MO的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法,并進(jìn)行了完整的方法確證。大鼠靜脈注射給藥MV后,可在大鼠血漿中同時(shí)檢測到MV和MO的存在,2min時(shí)MO與MV的濃度比僅為4.61%;但隨著時(shí)間的推移,MO與MV的濃度比越來越大,直至6 h時(shí)二者的比值為132%,表明MV在大鼠體內(nèi)可迅速脫糖,生成代謝產(chǎn)物MO。大鼠灌胃給藥MV后,在大鼠血漿中未檢出MV的存在,但可檢出少量的MO,并經(jīng)濃度和劑量歸一化處理后測得生物利用度值為8.73±1.46%。大鼠靜脈注射給藥MO后,MO在大鼠體內(nèi)的消除半衰期為1.40±0.09h。大鼠灌胃給藥MO后,MO在大鼠體內(nèi)的消除半衰期為2.41±0.11h,達(dá)峰時(shí)間tmax為0.39±0.10h,并經(jīng)劑量歸一化處理后獲得的絕對(duì)生物利用度值為10.3±2.15%。結(jié)果表明,口服給藥MV及其苷元MO后,MO可迅速吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),約在0.38 h達(dá)峰濃度。然而,生物利用度相對(duì)偏低,可能與首過效應(yīng)和給藥后在體內(nèi)發(fā)生強(qiáng)烈代謝相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284

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1 羅祖良;羅漢果葫蘆二烯醇的生物合成及葫蘆烷型三萜生物活性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2017年

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本文編號(hào)：1471710