本文關鍵詞： 食管腫瘤 鱗癌細胞 原代培養(yǎng) IGF1R Linsitinib 食管鱗癌 信號通路 食管鱗癌 Linsitinib 耐藥 NF-κBp65　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：食管癌是居全球死亡率第6的高度侵襲性惡性腫瘤。我國是食管癌高發(fā)的國家之一,接近70%的食管鱗癌病例發(fā)生在中國,其發(fā)病率和死亡率均居世界首位。當前食管鱗癌治療是基于根治性切除術聯(lián)合圍手術期化療或化放療的模式,但是由于仍未發(fā)現(xiàn)確實有效的分子治療靶點,其5年生存率僅為10%-25%。驅動基因指導下的分子靶向治療是實現(xiàn)食管鱗癌精準治療和改善患者預后的重要發(fā)展方向。目前制約食管鱗癌精準研究的最大屏障是缺乏有效研究模型。迄今為止,食管鱗癌的可用商業(yè)化細胞株比較少,常用的食管癌細胞株主要來源于日本,包括KYSE系列和TE系列。這些細胞系長期在體外傳代,為了適應體外培養(yǎng)的環(huán)境,一些已經喪失了原始腫瘤組織的特性。同時由于種族差異,生活習慣以及環(huán)境因素不同等因素,這些細胞能否代表我國食管癌的類型和特點存在很大的疑問。相比之下,來源于患者新鮮腫瘤組織的原代細胞株(PDC)因為較好的保存腫瘤的主要特征如組織學、基因組特征、細胞異質性和藥物反應等特點,與商業(yè)化的腫瘤細胞株相比,更能模擬腫瘤在患者體內生長的真實情況,有望打破目前食管癌臨床研究的瓶頸。我們課題組利用2014年05月至2015年12月在浙江省腫瘤醫(yī)院進行手術及胸水引流的原發(fā)食管鱗癌患者新鮮的腫瘤組織/胸水進行原代培養(yǎng),通過組織塊貼壁法以及胰酶消化法成功建立10株食管鱗癌的原代細胞株,并對其進行了包括染色體核型、STR分型檢測、細胞增殖、腫瘤標記物檢測、克隆形成以及裸鼠成瘤等實驗,確定了所建食管鱗癌原代細胞的生物學特性。我們進一步利用這些3-5代原代細胞株進行包括12種臨床常用化療藥物和9種已開展臨床試驗的靶向藥物的藥物篩選。結果發(fā)現(xiàn)16株原代細胞中,25%(4/16)細胞對胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)酪氨酸激酶抑制劑Linsitinib敏感,而25%(4/16)細胞相對耐受。利用Linsitinib作用于6株食管鱗癌商業(yè)化細胞株Eca-109、EC-9706、KYSE-510、KYSE-410、TE-1及TE-13,發(fā)現(xiàn)TE-13對Linsitinib敏感,而其余5株則相對耐受。我們進一步利用Western Blot檢測IGF1R的下游信號通路,發(fā)現(xiàn)Linsitinib通過抑制IGF1R下游PI3K/AKT/mTOR和Ras/MEK/ERK信號通路的激活發(fā)揮生物學效應。但在敏感株細胞中NF-κB p65活化受到抑制;而耐藥株中p65活化得到增強,細胞凋亡受到抑制。在耐藥株中將NF-κB的抑制劑JSH-23和Linsitinib合用,可以有效的增加耐藥株對Linsitinib的敏感性。綜上所述,我們建立的食管鱗癌原代細胞株模型,建系時間較短,性狀穩(wěn)定,以這些食管癌細胞系作為研究模型,對于了解中國人的原發(fā)性食管癌發(fā)生機理有很大幫助。并且我們利用這些原代細胞株進行藥物篩選發(fā)現(xiàn)Linsitinib可能是食管鱗癌潛在的靶向藥物。NF-κB信號通路的活化的食管鱗癌對Linsitinib原發(fā)耐藥,p65可能可以作為食管鱗癌Linsitinib療效預測分子標志物。第一部分食管鱗癌原代細胞株的建立目的:建立國人來源的食管鱗癌細胞的原代分離純化及培養(yǎng)方法,為研究食管癌的生物學特性、癌變機理、藥物篩選等提供必要的研究模型。方法:收集2014年05月至2015年12月在浙江省腫瘤醫(yī)院手術切除的原發(fā)食管鱗癌患者新鮮的腫瘤組織及胸水,利用組織塊貼壁法以及胰酶消化法建立食管鱗癌的原代細胞株10株。并對其通過形態(tài)觀察、染色體核型、STR分型進行鑒定;利用實時無標記細胞功能分析儀測定細胞增殖;免疫組化檢測腫瘤標記物cytokeratin 5/6(CK5/6),p63,cytokeratin 14(CK14),CgA,Sy,CD56 在細胞株的表達;利用克隆形成以及裸鼠成瘤等實驗檢測所建原代細胞株的成瘤性。結果:成功建立可體外穩(wěn)定傳代的食管鱗癌原代細胞株10株(ZEC-014、ZEC-056、ZEC-134、ZEC-157、ZEC-166、ZEC-043、ZEC-061、ZEC-118、ZEC-127、ZEC-145)。鏡下觀察呈扁平不規(guī)則多邊形,細胞彼此緊密相連,符合上皮樣細胞的特點。STR測序結果與ATCC、DSMZ等細胞保存庫的數(shù)據(jù)進行比對,顯示10株食管鱗癌細胞株均為新建細胞株。染色體核型檢測顯示染色體數(shù)目大多分布在34～85之間。10株細胞株腫瘤標記物檢測CK5/6、p63、CK14均為陽性,CgA、Sy、CD56均為陰性�？寺⌒纬蓪嶒炋崾窘臃N密度為4500個細胞時的細胞克隆形成能力較強。10株細胞中ZEC-014、ZEC-056、ZEC-134、ZEC-157和ZEC-166可在裸鼠皮下成瘤,而 ZEC-043,ZEC-061,ZEC-118,ZEC-127 和 ZEC-145 成瘤能力較差。結論:我們成功確立了原代食管鱗癌細胞分離、純化及培養(yǎng)的方法,建立了一系列食管鱗癌細胞株。所建立的細胞株具有各自的生物學特點,為今后食管癌的研究提供了研究工具。第二部分胰島素樣生長因子1受體抑制劑Linsitinib在食管鱗癌中的作用目的:尋找可用于食管鱗癌的分子靶向藥物,并探討IGF1R抑制劑Linsitinib在食管鱗癌中的作用。方法:利用MTT實驗檢測12種臨床常用化療藥物包括托泊替康(Topotecan)、伊立替康(Irinotecan)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、表柔比星(Epirubicin)、阿霉素(Doxorunicin)、吉西他濱(Gemcitabine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、紫杉醇(Paclitaxel)、卡培他濱(Capecitabine)、卡鉑(Carboplatin)和順鉑(Cisplatin),以及9種已開展臨床試驗的靶向藥物包括Afatinib、Bortezomib、Navitoclax、Sunitinib、Trametinib、Eriotinib、GDC-0941、MK-2206 和 Linsitinib對16株食管鱗癌原代細胞及6株商業(yè)化細胞(Eca-109/EC-9706/KYSE-510/KYSE-410/TE-1/TE-13)的增殖影響,選擇食管鱗癌潛在的靶向藥物。通過免疫印記實驗檢測Linsitinib抑制食管鱗癌增殖的機制。結果:MTT實驗發(fā)現(xiàn)16株原代細胞中,25%(4/16)細胞對Linsitinib敏感,而25%(4/16)細胞相對耐受。食管鱗癌商業(yè)化細胞株中TE-13對Linsitinib敏感,而其余5株則相對耐受。免疫印記實驗顯示Linsitinib能夠顯著降低食管鱗癌細胞TE-1、TE-13 和 KYSE-510 中 pAKT308、pAKT473、p-mTOR 以及 p-ERK1/2 的磷酸化水平。結論:Linsitinib 通過抑制 IGF1R 下游 PI3K/AKT/mTOR 和 Ras/MEK/ERK 信號通路的激活發(fā)揮生物學效應,可能是食管鱗癌潛在的靶向藥物第三部分食管鱗癌對胰島素樣生長因子1受體抑制劑Linsitinib原發(fā)耐藥的機制研究目的:Linsitinib是食管鱗癌潛在的小分子抑制劑,但是部分食管鱗癌患者對其原發(fā)耐受。目前,對于Linsitinib原發(fā)耐藥的機制還是很清楚。本研究主要探討食管鱗癌對Linsitinib耐藥的機制。方法:利用western blot檢測Linsitinib對食管鱗癌細胞TE-13、TE-1以及KYSE-510凋亡通路和NF-κB信號通路的影響。在食管鱗癌細胞上聯(lián)用Linsitinib與NF-κB抑制劑JSH-23,觀察細胞凋亡,細胞活力以及克隆形成的能力。結果:與對Linsitinib敏感的TE-13細胞相比,耐藥株TE-1及KYSE-510的凋亡受到明顯的抑制。通過對NF-κB信號通路的檢測發(fā)現(xiàn),敏感株細胞中p65活化受到抑制,同時p65下游的靶基因IL-6和IL-8的mRNA水平也顯著下調,而耐藥株則相反。在食管鱗癌細胞上聯(lián)用Linsitinib與NF-κB抑制劑JSH-23,能夠使得耐受的細胞對Linsitinib敏感。結論:NF-κB信號通路的活化介導了食管鱗癌對Linsitinib原發(fā)耐藥。合用NF-κB抑制劑JSH-23,能夠有效的克服食管鱗癌對Linsitinib耐藥。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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本文編號：1471246