發(fā)布時(shí)間：2018-01-28 18:40

  本文關(guān)鍵詞： 食管腫瘤 鱗癌細(xì)胞 原代培養(yǎng) IGF1R Linsitinib 食管鱗癌 信號(hào)通路 食管鱗癌 Linsitinib 耐藥 NF-κBp65　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：食管癌是居全球死亡率第6的高度侵襲性惡性腫瘤。我國(guó)是食管癌高發(fā)的國(guó)家之一,接近70%的食管鱗癌病例發(fā)生在中國(guó),其發(fā)病率和死亡率均居世界首位。當(dāng)前食管鱗癌治療是基于根治性切除術(shù)聯(lián)合圍手術(shù)期化療或化放療的模式,但是由于仍未發(fā)現(xiàn)確實(shí)有效的分子治療靶點(diǎn),其5年生存率僅為10%-25%。驅(qū)動(dòng)基因指導(dǎo)下的分子靶向治療是實(shí)現(xiàn)食管鱗癌精準(zhǔn)治療和改善患者預(yù)后的重要發(fā)展方向。目前制約食管鱗癌精準(zhǔn)研究的最大屏障是缺乏有效研究模型。迄今為止,食管鱗癌的可用商業(yè)化細(xì)胞株比較少,常用的食管癌細(xì)胞株主要來源于日本,包括KYSE系列和TE系列。這些細(xì)胞系長(zhǎng)期在體外傳代,為了適應(yīng)體外培養(yǎng)的環(huán)境,一些已經(jīng)喪失了原始腫瘤組織的特性。同時(shí)由于種族差異,生活習(xí)慣以及環(huán)境因素不同等因素,這些細(xì)胞能否代表我國(guó)食管癌的類型和特點(diǎn)存在很大的疑問。相比之下,來源于患者新鮮腫瘤組織的原代細(xì)胞株(PDC)因?yàn)檩^好的保存腫瘤的主要特征如組織學(xué)、基因組特征、細(xì)胞異質(zhì)性和藥物反應(yīng)等特點(diǎn),與商業(yè)化的腫瘤細(xì)胞株相比,更能模擬腫瘤在患者體內(nèi)生長(zhǎng)的真實(shí)情況,有望打破目前食管癌臨床研究的瓶頸。我們課題組利用2014年05月至2015年12月在浙江省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)及胸水引流的原發(fā)食管鱗癌患者新鮮的腫瘤組織/胸水進(jìn)行原代培養(yǎng),通過組織塊貼壁法以及胰酶消化法成功建立10株食管鱗癌的原代細(xì)胞株,并對(duì)其進(jìn)行了包括染色體核型、STR分型檢測(cè)、細(xì)胞增殖、腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)、克隆形成以及裸鼠成瘤等實(shí)驗(yàn),確定了所建食管鱗癌原代細(xì)胞的生物學(xué)特性。我們進(jìn)一步利用這些3-5代原代細(xì)胞株進(jìn)行包括12種臨床常用化療藥物和9種已開展臨床試驗(yàn)的靶向藥物的藥物篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)16株原代細(xì)胞中,25%(4/16)細(xì)胞對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)酪氨酸激酶抑制劑Linsitinib敏感,而25%(4/16)細(xì)胞相對(duì)耐受。利用Linsitinib作用于6株食管鱗癌商業(yè)化細(xì)胞株Eca-109、EC-9706、KYSE-510、KYSE-410、TE-1及TE-13,發(fā)現(xiàn)TE-13對(duì)Linsitinib敏感,而其余5株則相對(duì)耐受。我們進(jìn)一步利用Western Blot檢測(cè)IGF1R的下游信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)Linsitinib通過抑制IGF1R下游PI3K/AKT/mTOR和Ras/MEK/ERK信號(hào)通路的激活發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。但在敏感株細(xì)胞中NF-κB p65活化受到抑制;而耐藥株中p65活化得到增強(qiáng),細(xì)胞凋亡受到抑制。在耐藥株中將NF-κB的抑制劑JSH-23和Linsitinib合用,可以有效的增加耐藥株對(duì)Linsitinib的敏感性。綜上所述,我們建立的食管鱗癌原代細(xì)胞株模型,建系時(shí)間較短,性狀穩(wěn)定,以這些食管癌細(xì)胞系作為研究模型,對(duì)于了解中國(guó)人的原發(fā)性食管癌發(fā)生機(jī)理有很大幫助。并且我們利用這些原代細(xì)胞株進(jìn)行藥物篩選發(fā)現(xiàn)Linsitinib可能是食管鱗癌潛在的靶向藥物。NF-κB信號(hào)通路的活化的食管鱗癌對(duì)Linsitinib原發(fā)耐藥,p65可能可以作為食管鱗癌Linsitinib療效預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物。第一部分食管鱗癌原代細(xì)胞株的建立目的:建立國(guó)人來源的食管鱗癌細(xì)胞的原代分離純化及培養(yǎng)方法,為研究食管癌的生物學(xué)特性、癌變機(jī)理、藥物篩選等提供必要的研究模型。方法:收集2014年05月至2015年12月在浙江省腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)食管鱗癌患者新鮮的腫瘤組織及胸水,利用組織塊貼壁法以及胰酶消化法建立食管鱗癌的原代細(xì)胞株10株。并對(duì)其通過形態(tài)觀察、染色體核型、STR分型進(jìn)行鑒定;利用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀測(cè)定細(xì)胞增殖;免疫組化檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物cytokeratin 5/6(CK5/6),p63,cytokeratin 14(CK14),CgA,Sy,CD56 在細(xì)胞株的表達(dá);利用克隆形成以及裸鼠成瘤等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所建原代細(xì)胞株的成瘤性。結(jié)果:成功建立可體外穩(wěn)定傳代的食管鱗癌原代細(xì)胞株10株(ZEC-014、ZEC-056、ZEC-134、ZEC-157、ZEC-166、ZEC-043、ZEC-061、ZEC-118、ZEC-127、ZEC-145)。鏡下觀察呈扁平不規(guī)則多邊形,細(xì)胞彼此緊密相連,符合上皮樣細(xì)胞的特點(diǎn)。STR測(cè)序結(jié)果與ATCC、DSMZ等細(xì)胞保存庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),顯示10株食管鱗癌細(xì)胞株均為新建細(xì)胞株。染色體核型檢測(cè)顯示染色體數(shù)目大多分布在34～85之間。10株細(xì)胞株腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)CK5/6、p63、CK14均為陽(yáng)性,CgA、Sy、CD56均為陰性�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)提示接種密度為4500個(gè)細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞克隆形成能力較強(qiáng)。10株細(xì)胞中ZEC-014、ZEC-056、ZEC-134、ZEC-157和ZEC-166可在裸鼠皮下成瘤,而 ZEC-043,ZEC-061,ZEC-118,ZEC-127 和 ZEC-145 成瘤能力較差。結(jié)論:我們成功確立了原代食管鱗癌細(xì)胞分離、純化及培養(yǎng)的方法,建立了一系列食管鱗癌細(xì)胞株。所建立的細(xì)胞株具有各自的生物學(xué)特點(diǎn),為今后食管癌的研究提供了研究工具。第二部分胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體抑制劑Linsitinib在食管鱗癌中的作用目的:尋找可用于食管鱗癌的分子靶向藥物,并探討IGF1R抑制劑Linsitinib在食管鱗癌中的作用。方法:利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)12種臨床常用化療藥物包括托泊替康(Topotecan)、伊立替康(Irinotecan)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、表柔比星(Epirubicin)、阿霉素(Doxorunicin)、吉西他濱(Gemcitabine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、紫杉醇(Paclitaxel)、卡培他濱(Capecitabine)、卡鉑(Carboplatin)和順鉑(Cisplatin),以及9種已開展臨床試驗(yàn)的靶向藥物包括Afatinib、Bortezomib、Navitoclax、Sunitinib、Trametinib、Eriotinib、GDC-0941、MK-2206 和 Linsitinib對(duì)16株食管鱗癌原代細(xì)胞及6株商業(yè)化細(xì)胞(Eca-109/EC-9706/KYSE-510/KYSE-410/TE-1/TE-13)的增殖影響,選擇食管鱗癌潛在的靶向藥物。通過免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Linsitinib抑制食管鱗癌增殖的機(jī)制。結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)16株原代細(xì)胞中,25%(4/16)細(xì)胞對(duì)Linsitinib敏感,而25%(4/16)細(xì)胞相對(duì)耐受。食管鱗癌商業(yè)化細(xì)胞株中TE-13對(duì)Linsitinib敏感,而其余5株則相對(duì)耐受。免疫印記實(shí)驗(yàn)顯示Linsitinib能夠顯著降低食管鱗癌細(xì)胞TE-1、TE-13 和 KYSE-510 中 pAKT308、pAKT473、p-mTOR 以及 p-ERK1/2 的磷酸化水平。結(jié)論:Linsitinib 通過抑制 IGF1R 下游 PI3K/AKT/mTOR 和 Ras/MEK/ERK 信號(hào)通路的激活發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),可能是食管鱗癌潛在的靶向藥物第三部分食管鱗癌對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體抑制劑Linsitinib原發(fā)耐藥的機(jī)制研究目的:Linsitinib是食管鱗癌潛在的小分子抑制劑,但是部分食管鱗癌患者對(duì)其原發(fā)耐受。目前,對(duì)于Linsitinib原發(fā)耐藥的機(jī)制還是很清楚。本研究主要探討食管鱗癌對(duì)Linsitinib耐藥的機(jī)制。方法:利用western blot檢測(cè)Linsitinib對(duì)食管鱗癌細(xì)胞TE-13、TE-1以及KYSE-510凋亡通路和NF-κB信號(hào)通路的影響。在食管鱗癌細(xì)胞上聯(lián)用Linsitinib與NF-κB抑制劑JSH-23,觀察細(xì)胞凋亡,細(xì)胞活力以及克隆形成的能力。結(jié)果:與對(duì)Linsitinib敏感的TE-13細(xì)胞相比,耐藥株TE-1及KYSE-510的凋亡受到明顯的抑制。通過對(duì)NF-κB信號(hào)通路的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),敏感株細(xì)胞中p65活化受到抑制,同時(shí)p65下游的靶基因IL-6和IL-8的mRNA水平也顯著下調(diào),而耐藥株則相反。在食管鱗癌細(xì)胞上聯(lián)用Linsitinib與NF-κB抑制劑JSH-23,能夠使得耐受的細(xì)胞對(duì)Linsitinib敏感。結(jié)論:NF-κB信號(hào)通路的活化介導(dǎo)了食管鱗癌對(duì)Linsitinib原發(fā)耐藥。合用NF-κB抑制劑JSH-23,能夠有效的克服食管鱗癌對(duì)Linsitinib耐藥。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1471246