本文關(guān)鍵詞： Smad3 膿毒癥肺損傷 自噬 microRNA DMF　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景膿毒癥是臨床最常見的嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷以及大手術(shù)后之的并發(fā)癥,短時間內(nèi)可發(fā)展成為多器官功能障礙綜合征,是當(dāng)前創(chuàng)傷、燒傷和外科危重病人死亡的最主要原因。其中膿毒癥相關(guān)急性肺損傷不但出現(xiàn)最早、發(fā)生率最高,而且進(jìn)展迅速,病死率可高達(dá)70%~90%,目前并無有效治療手段。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)膿毒癥背景下Smad3可以降低重要臟器對LPS的敏感性。同時研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路與自噬密切相關(guān),而自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞的生命現(xiàn)象,具有吞噬病原體、調(diào)解炎癥反應(yīng)、減輕細(xì)胞凋亡等作用。因此我們認(rèn)為Smad3對膿毒癥的保護(hù)機(jī)制和自噬反應(yīng)密切相關(guān)。另外,Smad3的表達(dá)與活化還能夠受到轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié),這一類的調(diào)節(jié)因素主要是由非編碼RNA包括microRNA介導(dǎo)的,而外泌體作為人體內(nèi)一類重要囊泡,其中包含的主要是非編碼RNA(miroRNA,LncRNA等)。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞會通過分泌外泌體囊泡將信號分子傳遞到較遠(yuǎn)的組織或細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用。但是在膿毒癥的微環(huán)境中,肺組織細(xì)胞釋放的外泌體中是否包含影響Smad3表達(dá)與活化的microRNAs,并且進(jìn)一步影響到膿毒癥患者預(yù)后的研究,目前尚未見報道。鑒于Smad3在膿毒癥中發(fā)揮保護(hù)作用,利用現(xiàn)有藥物樣本庫篩選針對Smad3本身活化的臨床藥物亦是防治膿毒癥的策略之一。在未獲得Smad3擬效劑的情況下,以膿毒癥致病機(jī)制的關(guān)鍵信號通路——LPS-TLR4通路著手展開針對膿毒癥防治的研究。綜上所述,我們利用Smad3基因缺陷小鼠探討Smad3在膿毒癥肺損傷中和自噬的關(guān)系,同時通過利用臨床膿毒癥患者血清標(biāo)本,查找靶向調(diào)控Smad3的外泌體miRNAs,最后通過篩選通路抑制劑藥物來綜合探討膿毒癥防治新策略。第一部分Smad3調(diào)控自噬減輕膿毒癥肺損傷的作用研究研究目的:通過建立體內(nèi)外Smad3(-/-)小鼠膿毒癥肺損傷模型,觀察smad3敲除后自噬相關(guān)基因表達(dá)的變化。研究方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過氣道滴入LPS構(gòu)建膿毒癥急性肺損傷模型,體外實(shí)驗(yàn)通過慢病毒包裝構(gòu)建穩(wěn)定干擾Smad3的BEAS-2B細(xì)胞系,然后LPS刺激建立體外模型,通過電鏡、HE染色、免疫組化以及ELISA,qPCR、蛋白免疫印跡法等分子生物學(xué)方法觀察炎癥損傷情況以及檢測自噬相關(guān)基因的表達(dá)變化。研究結(jié)果:1.smad3基因敲除后小鼠膿毒癥肺損傷加重,肺干濕重比增加(*p0.05);he染色ko組肺泡塌陷更多,出血明顯,中性粒細(xì)胞浸潤較wt組更多;elisa檢測小鼠血清和肺泡盥洗液tnf-a和il-6的表達(dá)明顯高于wt對照組(*p0.05)。2.損傷早期(6h)電鏡下ko組自噬小體形成明顯增加,但自噬蛋白lc3mrna水平表達(dá)下降(*p0.05),蛋白水平卻表達(dá)增加;3.成功構(gòu)建si-smad3beas-2b細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)6h時自噬蛋白lc3blps-shsmad3組較lps-nc組表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論:smad3敲除后小鼠膿毒癥肺損傷加重,自噬增加。smad3可能通過調(diào)控自噬來降低肺對lps的易感性。第二部分外泌體mirnas調(diào)控smad3減輕膿毒癥肺損傷研究目的:利用小rna高通量測序和基因芯片技術(shù)檢測動物和患者血清外泌體,篩選出靶向調(diào)控smad3的mirnas,并驗(yàn)證其調(diào)控自噬的機(jī)制。研究方法:以smad3(-/-)小鼠構(gòu)建氣道滴入lps膿毒癥急性肺損傷模型,收集小鼠肺組織一部分通過wb檢測smad3活化情況,一部分進(jìn)行高通量測序,提取血清和肺泡盥洗液外泌體進(jìn)行基因芯片檢測,再結(jié)合臨床膿毒癥患者不同時期的血清外泌體進(jìn)行小rna高通量測序,通過組間差異分析以及聚類分析等生物信息學(xué)手段篩選受smad3調(diào)控的下游mirnas和靶向調(diào)控smad3的上游mirnas,最后用beas-2b細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證目的mirna是否調(diào)控自噬。研究結(jié)果:1.膿毒癥小鼠急性肺損傷6h之后,smad3磷酸化表達(dá)顯著升高。2.肺組織測序發(fā)現(xiàn)smad3敲除之后,mir-574-5p表達(dá)減少,而血清和肺泡盥洗液外泌體基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)ko/wt表達(dá)增高的有mir-1196-5p,mir-574-5p,但mir-1196在肺組織測序中沒有檢測到。3.在lps刺激下,mir-574-5p模擬物外源性刺激beas-2b細(xì)胞系,自噬表達(dá)上調(diào);而用mir-574-5p抑制劑可以抑制自噬的表達(dá)。4.膿毒癥患者血清外泌體小rna測序后組間差異分析發(fā)現(xiàn)對照組和燒傷后10天患者的血清外泌體mirna相比,有顯著差異p0.01的共有69個;和燒傷后20天的患者血清外泌體mirna比較,兩組有顯著差異p0.01的共有74個;和燒傷后30天組相比,兩組有顯著差異p0.01的共有42個。5.時間序列分析篩選出差異表達(dá)下降的mirnas,再進(jìn)行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)和smad3,LC3B同時相關(guān)的一共有5個,分別是miR-9-5p,miR-3135b,miR-432-5p,miR-409-3p,miR-744-5p。經(jīng)體外細(xì)胞系RAW264.7膿毒癥模型驗(yàn)證其表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)變化趨勢和臨床膿毒癥患者血清基本一致。結(jié)論:1.小鼠膿毒癥肺損傷早期Smad3缺失導(dǎo)致自噬上調(diào),其機(jī)制可能與肺上皮細(xì)胞分泌miR-574誘導(dǎo)自噬發(fā)生有關(guān)。2.smad3基因在臨床膿毒癥患者中發(fā)揮的保護(hù)作用可能與上游靶向調(diào)控它的miRNAs下降有關(guān)。第三部分LPS-TLR4信號通路抑制劑DMF防治膿毒癥機(jī)制研究目的:分子層面探索DMF抑制LPS-TLR4信號活化的機(jī)制并驗(yàn)證其對膿毒癥的防治作用。研究方法:從臨床藥物庫篩選LPS-TLR4通路抑制劑DMF,利用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞,設(shè)不同的DMF濃度梯度組,采用免疫蛋白印跡檢測NFkB信號通路中4個關(guān)鍵蛋白的活化情況。最后以LPS腹腔注射構(gòu)建膿毒癥模型,通過動物生存率實(shí)驗(yàn)觀察其對膿毒癥的防治效果。研究結(jié)果:1.RAW細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后DMF干預(yù)組,NO濃度依次降低,iNOS表達(dá)受到抑制;同時DMF抑制LPS-TLR4通路下游IKK,Ik B,NFkB磷酸化表達(dá),而IRAK蛋白表達(dá)沒有變化。2.生存率時間效應(yīng)梯度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有術(shù)前給藥36h和48h能達(dá)到50%的生存率,(*p0.05),生存率劑量效應(yīng)梯度實(shí)驗(yàn)證實(shí)DMF30mg/Kg可以提高小鼠膿毒癥生存率50%,15mg/Kg可以提升25%(*p0.05)。3.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明DMF可以有效抑制炎癥因子TNF-a,IL-6,IL-10的表達(dá)(*P0.05),另外HE染色顯示膿毒癥背景下DMF處理組肺、肝、腎損傷較LPS損傷組明顯減輕。4.在DMF和UTI的聯(lián)合作用下,促炎因子IL-6和IL-1β,抑炎因子IL-10轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均受到明顯抑制,聯(lián)合用藥進(jìn)一步提升膿毒癥小鼠生存率90%-100%。結(jié)論:DMF抑制LPS-TLR4信號通路的作用靶點(diǎn)在于抑制IKK蛋白磷酸化,并且可以有效防治膿毒癥,聯(lián)合烏司他丁可以進(jìn)一步大幅度降低膿毒癥死亡率接近于0。
[Abstract]:It is found that Smad3 can decrease the sensitivity of important organs to LPS . It is found that Smad3 is closely related to autophagy . In this paper , we investigated the relationship between the expression of Smad3 and activated microRNAs and the expression of autophagy - related genes in sepsis . The results of this study were as follows : 1 . There were significant differences between the two groups . The results were as follows : 1 . The results of the study were as follows : 1 . The results of the study were as follows : 1 . The results showed that : 1 . After LPS - stimulated LPS - stimulated LPS - 4 - 5p inhibitor DMF , there were significant differences between the two groups . The results showed that : 1 . The concentration of NO in DMF was decreased and the expression of iNOS was inhibited . Conclusion : DMF can inhibit the phosphorylation of IKK protein and effectively prevent sepsis .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R459.7

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本文編號：1463104