本文關鍵詞： DKK2 結直腸癌 DNA甲基化 Wnt/β-catenin 抑癌基因　出處：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：癌癥是全球重大的公共衛(wèi)生問題,同時也是各國最主要的致死性疾病之一。據(jù)2017年度美國國家癌癥中心數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示:美國所有癌癥疾病中,結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)的發(fā)病率和死亡率高居前三位[1]。而在發(fā)展中國家,癌癥發(fā)病率和死亡率遠高于發(fā)達國家,據(jù)2016年發(fā)表于美國CA CANCER J CLIN雜志的中國癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示[2]:中國癌癥患者的發(fā)病和死亡人數(shù)呈不斷上升的趨勢,2015年大約281400名患者死于癌癥,平均每天7500名患者。結直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,隨著經(jīng)濟發(fā)展及生活水平的改善,其發(fā)病率及死亡率有不斷上升的趨勢;因此,尋找新的癌癥治療方法對腫瘤病患者治療和預防有重要意義。DKK2(Dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 2)是WNT信號通路最常見的調(diào)控因子,其家族成員主要包含4個(DKK1,DKK2,DKK3,DKK4),均為外分泌型蛋白。其中DKK2位于染色體4q25,基因長度149 kb,編碼的蛋白約28 kd。目前已有文獻報道:DKK2在腎癌、卵巢癌組織中存在著不同程度的甲基化及組織表達下調(diào),同時有抑制腫瘤細胞生長、侵襲等生物學能力[3-4];在消化道腫瘤中存在不同程度的甲基化現(xiàn)象[5-6],但其在結直腸癌中的功能及相關分子機制尚不清楚。因此我們推測DKK2可能作為抑癌基因(Tumor suppressor gene,TSG)參與結直腸癌的進程。本研究采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、甲基化特異性聚合鏈式反應(Methylation specific PCR,MSP)、在線數(shù)據(jù)庫分析等方法分析了DKK2在結直腸癌細胞系及組織中的表達和甲基化狀態(tài);同時體外實驗和體內(nèi)實驗檢測DKK2對細胞增殖及遷移的影響,并進一步采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time fluorescence quantiattive polymerase chain reaction,qRT-PCR)、RT-PCR及蛋白印跡法(Western blot,WB)等方法檢測DKK2對增殖及遷移能力影響的相關分子機制。結果發(fā)現(xiàn):DKK2基因在7株(100%)結直腸癌細胞中均有不同程度的表達下調(diào)或缺失;聯(lián)合去甲基化藥物5-氮雜-2脫氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-Aza-dC)及組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲骨菌素A(Trichostatin A,TSA)處理后,DKK2信使RNA(Messenger RNA,mRNA)表達下調(diào)或沉默的細胞株(HCT116、HT-29、SW480)能恢復表達;同時MSP發(fā)現(xiàn),A+T處理后細胞(HT-29),其甲基化程度有不同程度的降低,因此提示了DKK2啟動子甲基化可能是導致mRNA表達水平下調(diào)的主要原因之一。體外功能實驗發(fā)現(xiàn):DKK2能通過Wnt/β-catenin通路抑制腫瘤的生長及遷移。綜上所述,DKK2作為抑癌基因參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展,可能為結直腸癌早期診斷及治療提供了相關分子依據(jù)。
[Abstract]:Cancer is a major public health problem in the world and one of the leading fatal diseases in the world. According to the National Cancer Center of the United States in 2017, all cancer diseases in the United States show that. The incidence and mortality rate of Colorectal Cancer CRC are among the top three. [1. In developing countries, cancer morbidity and mortality are much higher than in developed countries, according to Chinese cancer statistics published in 2016 in the journal CA CANCER J CLIN. [2]: the incidence and death of cancer patients in China is on the rise. In 2015, about 281400 patients died of cancer. Colorectal cancer is one of the most common malignant tumors of digestive tract. With the development of economy and the improvement of living standard, the morbidity and mortality of colorectal cancer are increasing. So... Finding new methods of cancer treatment is of great significance for the treatment and prevention of oncology. Dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 2) is the most common regulator of WNT signaling pathway. The family members are mainly composed of four DKK1DK2DKK3DKK3DKK4, all of which are exocrine proteins, in which DKK2 is located on chromosome 4q25 and the gene length is 149kb. It has been reported that there are different degrees of methylation and down-regulation of tissue expression in renal cell carcinoma and ovarian cancer, and also inhibit the growth of tumor cells. Invasion and other biological abilities. [3-4]; there are different degrees of methylation in digestive tract tumors. [5-6, but its function and related molecular mechanism in colorectal cancer are not clear. Therefore, we speculate that DKK2 may be used as tumor suppressor gene or suppressor gene. TSGs were involved in the progression of colorectal cancer. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used in this study. Reverse transcription polymerase chain reaction. RT-PCR, methylation specific PCR. The expression and methylation of DKK2 in colorectal cancer cell lines and tissues were analyzed by on-line database analysis. At the same time, the effects of DKK2 on cell proliferation and migration were detected in vitro and in vivo. Furthermore, real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (. Real-time fluorescence quantiattive polymerase chain reaction. QRT-PCRX RT-PCR and Western blotting were used to detect Western blot. The molecular mechanism of the effect of DKK2 on proliferation and migration was detected by WB. the results showed that the gene of 1: DKK2 was found in 7 strains. In colorectal cancer cells, the expression was down-regulated or absent to varying degrees. Combined with demethylated drug 5-aza-2-deoxycytidine 5-aza-2-deoxycytidine (5-aza-2-deoxycytidine). After treatment with 5-Aza-dC and histone deacetylase inhibitor ATrichostatin (TSA). The down-regulated or silenced DKK2 messenger RNA(Messenger mRNAs can restore the expression of HCT116 (HT-29V480). At the same time, MSP found that the methylation degree of HT-29 cells was decreased in different degree after treated with T. The results suggest that methylation of DKK2 promoter may be one of the main causes of down-regulation of mRNA expression. DKK2 can inhibit tumor growth and migration through Wnt- 尾 -catenin pathway. As a tumor suppressor gene, DKK2 is involved in the development of colorectal cancer, which may provide molecular basis for early diagnosis and treatment of colorectal cancer.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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本文編號：1461610