發(fā)布時(shí)間：2018-01-24 22:08

  本文關(guān)鍵詞： 肝細(xì)胞肝癌 NEK2 細(xì)胞增殖 凋亡及周期 腫瘤干細(xì)胞　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分NEK2在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系目的觀察NEK2在肝細(xì)胞肝癌(HCC)組織及癌旁肝組織中的表達(dá)情況,初步探討NEK2在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法1.Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析NEK2在HCC中的mRNA表達(dá)情況;2.免疫組化(IHC)檢測(cè)HCC中NEK2蛋白水平的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)顯示NEK2 mRNA水平在HCC中的表達(dá)高于癌旁肝組織。IHC檢測(cè)40例HCC和癌旁肝組織,發(fā)現(xiàn)NEK2的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上,40例肝癌患者標(biāo)本中有23例呈高表達(dá)(57.5%),而癌旁中僅有3例呈高表達(dá)(7.5%),說(shuō)明NEK2在蛋白表達(dá)水平上肝癌組織高于癌旁肝組織。收集分析136例HCC相關(guān)臨床病理資料,在腫瘤組織中NEK2的高表達(dá)與HCC患者的腫瘤大小(P=0.002)、TNM分期(P=0.028)及癌栓有無(wú)(P=0.039)呈正相關(guān)(均P0.05)。Kaplan-Meier法發(fā)現(xiàn)NEK2高表達(dá)患者總生存率(P0.01)與無(wú)瘤生存率(P0.05)比低表達(dá)者要差。Cox的單因素和多因素分析均顯示NEK2在肝癌組織中的高表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。結(jié)論1.NEK2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平在肝癌組織中高于癌旁肝組織;2.肝癌組織中NEK2高表達(dá)與肝癌的大小、TNM分期和癌栓呈正相關(guān);3.NEK2高表達(dá)是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立因素。第二部分NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響目的研究NEK2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響。方法1.Real-time PCR比較NEK2在肝癌細(xì)胞株與肝細(xì)胞株的表達(dá)情況;2.采用 siNEK2 轉(zhuǎn)染肝癌 HCCLM3 和 Hep-3B 細(xì)胞,Real-time PCR 和 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NEK2 mRNA和蛋白的表達(dá)變化;3.siNEK2沉默HCCLM3和Hep-3B細(xì)胞中的NEK2表達(dá)后,MTS法和單克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖以及流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期的變化。結(jié)果在Hep-G2,Hep-3B,HuH-7,SMMC7721,HCCLM3,Snu387和Snu475共7株肝癌細(xì)胞株中,Real-time PCR顯示NEK2在mRNA表達(dá)水平上均高于肝細(xì)胞株Chang liver。采用 siNEK2轉(zhuǎn)染肝癌HCCLM3和Hep-3B細(xì)胞,Real-time PCR和Western blot顯示轉(zhuǎn)染后的NEK2 mRNA(P0.001)和蛋白均明顯下調(diào)。MTS法(P0.05)和單克隆形成實(shí)驗(yàn)(P0.01)顯示siNEK2可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖。與對(duì)照組相比,siNEK2轉(zhuǎn)染48 h后,流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)發(fā)生凋亡的肝癌細(xì)胞增加(P0.05),Western blot發(fā)現(xiàn)BAD和C-caspase-3的表達(dá)上調(diào),而抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)下調(diào);流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析HCCLM3和Hep-3B的細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)siNEK2使處于G2/M期的細(xì)胞比例減少(P0.05),細(xì)胞內(nèi)CyclinB1和CDK1的蛋白表達(dá)水平下降,P27的蛋白表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論1.化學(xué)合成的siNEK2能夠有效的下調(diào)NEK2在肝癌細(xì)胞株HCCLM3和Hep-3B細(xì)胞中的表達(dá)水平;2.siNEK2后能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞有絲分裂。第三部分NEK2在維持肝癌腫瘤干細(xì)胞自我更新能力和化療藥物耐藥的作用目的研究NEK2在維持肝癌腫瘤干細(xì)胞自我更新能力和化療藥物耐藥的作用。方法1.用單克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞微球形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siNEK2對(duì)HCCLM3和Hep-3B細(xì)胞自我更新能力的影響,CCK-8檢測(cè)siNEK2后細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化;2.Western blot檢測(cè)siNEK2后HCCLM3和Hep-3B腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的變化;3.Real-time PCR 和 Western blot 檢測(cè) siNEK2 后在 HCCLM3 和 Hep-3B 細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin及其靶基因的變化。結(jié)果與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比,單克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示siNEK2組腫瘤細(xì)胞的單克隆形成能力明顯下降(P0.01),微球形成實(shí)驗(yàn)亦顯示siNEK2組HCCLM3(P0.001)和Hep-3B(P0.01)細(xì)胞的微球形成能力明顯低于對(duì)照組。CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siNEK2組肝癌細(xì)胞對(duì)5-Fu和Cisplatin藥物敏感性明顯高于對(duì)照組(P0.05)。Western blot顯示腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物Nanog、Sox2和Bmi1的蛋白表達(dá)水平,siNEK2組較對(duì)照組明顯下降。Western blot在顯示siNEK2后Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin降低的同時(shí),Real-timePCR發(fā)現(xiàn)β-catenin入核調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的靶基因EpCAM、c-Myc和CD133也明顯下降(P0.01)。Wnt3a是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激動(dòng)劑,在siNEK2組細(xì)胞中加入Wnt3a,發(fā)現(xiàn)Wnt3a可以部分恢復(fù)因siNEK2受抑制的細(xì)胞微球形成能力(P0.01)。結(jié)論1.siNEK2后能夠抑制肝癌細(xì)胞HCCLM3和Hep-3B的腫瘤干細(xì)胞特性,包括微球形成能力和化療藥物耐藥性;2.NEK2對(duì)肝癌腫瘤干細(xì)胞特性的作用,包括維持自我更新能力和化療藥物的耐藥,可能是通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:The expression of NEK2 mRNA and protein in HCC was significantly higher than that in HCC . The results showed that siNEK2 could inhibit the expression of 尾 - catenin and its target genes in HCCLM3 and Hep3B cells after siNEK2 .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1461152